熒光觀察法在醫(yī)學領域有著廣泛的用途，如免疫學研究的對象是抗原和抗體的反應問題，由于抗體反應的高度特異性，所以當抗原體發(fā)生反應時，只要知道其中一個因子，也就可以知道另一個因子。
但是這個過程必須通過染色，熒光染色劑就應運而生。
由于熒光染色的色素只需極稀的濃度便能使激發(fā)出明亮的熒光。因而，染色后不會破壞抗體（或抗原）原有的特異活性。
其光學原理示意圖如下，以藍光激發(fā)為例：

激發(fā)濾光片                                     熒光本                       截止濾光片

光源發(fā)出多種波長的光線，經(jīng)激發(fā)濾光片后只能通過某種單色的激發(fā)光，熒光標本在激發(fā)光作用下，激發(fā)出某種特定的顏色光（熒光）。由于被激發(fā)的熒光能量很弱，只能在黑暗的背景才易于觀察
到，所以增加了抑制濾光片使殘余的激發(fā)光不能通過。
早期的熒光觀察采用透射照明，它有很大的缺陷，當激發(fā)光透過標本組織時，很大部分的光線被衰減掉，到達我們需觀察的標本上表面時，只能激發(fā)出微弱的熒光。
近代的熒光觀察采用落射照明，如下圖所示：

圖中 ：
1．光源
2. 激發(fā)濾光片
3. 物鏡
4. 標本
5. 二向性分光鏡
6. 抑制濾光片
7. 目鏡

A> 光源
根據(jù)不同的激發(fā)光需要，可以選用三種光源，鹵素燈，高壓汞燈和氙燈。下圖列出菲利浦公司高壓汞燈和氙燈的光譜特性曲線。

高壓汞燈的光譜特性曲線                          氙燈的光譜特性曲線

由圖知，高壓汞燈是線狀光譜，對于某些波長光線有很高的強度，它適用很多染色法。
氙燈在300～800nm 波長內幾乎可以看作連續(xù)光譜，雖然是某些波長的強度不如汞燈，但它適用于所有熒光染色法。
鹵素燈也是連續(xù)光譜，它在藍光，綠光處也有較高的強度（但遠低于汞燈，氙燈）因此，對于只用藍光，綠光激發(fā)的簡易熒光顯微鏡可以選用鹵素燈。
通常采用50W汞燈，100W 汞燈75W氙燈及100W 鹵素燈作熒光光源。
圖中物鏡既起成象作用，又起聚光鏡作用。為了獲得很好的觀察效果，在熒光很微弱的場合如細菌發(fā)出的熒光。建議采用大數(shù)值孔徑物鏡，如徠卡的熒石物鏡，平場復消色差物鏡。
正因為物鏡又兼聚光鏡作用，所以物鏡中玻璃材料，透鏡間膠合劑，以及浸油必須確保在激發(fā)光下不會自發(fā)熒光。
為了使用方便，常將激發(fā)濾光片，二向性分光鏡及抑制濾光片組合成一個模塊。對于不同的熒光染色法，必須選用合適的模塊才能得到滿意的結果。所謂二向性分光鏡對激發(fā)光具有高反射率，而對激發(fā)出的熒光具有高透過率。

B> 常用熒光模塊
一般熒光模塊有如下四種：
近紫外光激發(fā)模塊――UV、 紫光激發(fā)模塊――V、 藍光激發(fā)模塊――B、 綠光激發(fā)模塊――G
這些模塊對應著不同染色法，如B 模塊常用FITC 染色法，G 模塊常用羅達明B200 染色法。
必須特別指出，激發(fā)光的波段曲線絕對不能與抑制光的波段曲線部分重迭，否則，視場中的背景
光全部是激發(fā)光的顏色,而微弱的熒光完全被掩蓋住,正如白天天空中無法看到星光一樣。

1─激發(fā)光 2─抑制光

藍光激發(fā)如用FITC 染色法，它的激發(fā)波段為480～490nm,被激發(fā)的熒光波長為510nm。由圖知，無論激發(fā)光或抑制光在500 nm 處均截止，無相交重迭。所以，殘留的激發(fā)光無法通過截止濾光
片，視場背景是黑暗的，而熒光則可順利地透過截止濾光片，形成熒光圖像。
徠卡公司設置了許多模塊，供不同的染色法選用：

注意：
許多熒光標本無法長期保存，特別在激發(fā)光照射下，熒光很快消失。所以，在停止觀察時，應該將激發(fā)光擋。但是汞燈開啟到熄滅后，第二次再啟動時，必須待燈源冷卻后才能進行。為此，須在模塊前設置一擋板（Shutter），可隨時關閉、開啟。

                                           熒光“激發(fā) / 發(fā)射”模塊

標本圖像(藍光激發(fā))                                              標本圖像(紫外光激發(fā))

標本圖像(綠光激發(fā))                                      標本圖像(藍光+紫外光激發(fā))