搜索仍然是在1930年找到一種方法使用未染色的對(duì)象不吸收光產(chǎn)生良好對(duì)比度的圖像直接和衍射光從各個(gè)方位。在此期間，由Frits Zernike研究露天零階和偏離的光，可以進(jìn)行修改，以產(chǎn)生干擾的有利條件和對(duì)比度增強(qiáng)的相位和振幅之間的差異。

未染色的標(biāo)本不吸收光的相位被稱為對(duì)象，因?yàn)樗鼈兩晕⒏淖冊(cè)嚇拥?a title='衍射' target='_blank' href='http://m.w095.cn/xinwen/476.html' class='seolabel'>衍射的光的相位，通常是通過(guò)延緩這樣的光相比，約1/4波長(zhǎng)的不偏離的直接光通過(guò)試樣周圍不受影響。不幸的是，我們的眼睛和相機(jī)膜，無(wú)法檢測(cè)到這些階段的差異。在此重申，人眼敏感的可見光譜的顏色（光頻率的變化）或不同程度的光強(qiáng)度（波的振幅的變化）。

在第一階段的標(biāo)本，直接零階光穿過(guò)或前后試樣不偏離。但是，試樣的光衍射的幅度在減小，因?yàn)樗窃趯?duì)象的光吸收，但速度降低的試樣，由于試樣的折射率或厚度（或兩者）。大約1/4波長(zhǎng)的滯后，這種衍射光，到達(dá)上面的不偏離的光的步驟（也稱為相位）與圖像平面，但在干擾強(qiáng)度基本上不受減損。其結(jié)果是，上面目鏡水平的圖像，所以缺乏對(duì)比度，使細(xì)節(jié)幾乎看不見。

制定未染色的方法-現(xiàn)在被稱為相差顯微鏡- 澤尼克成功，相對(duì)象產(chǎn)生對(duì)比度的圖像，好像他們是振幅對(duì)象。振幅對(duì)象顯示優(yōu)異的對(duì)比度時(shí)，衍射和直射光步驟（顯示的相位差）的波長(zhǎng)的1/2。Zernike的方法是加快由1/4波長(zhǎng)，使直接光的相位標(biāo)本的直接和偏離光之間的波長(zhǎng)差，現(xiàn)在是1/2波長(zhǎng)。其結(jié)果是，直接和衍射光到達(dá)目鏡圖像的水平將是能夠產(chǎn)生相消干涉（見吸收先前所描述的對(duì)象上形成圖像的部分）。出現(xiàn)對(duì)較亮的背景暗的圖像的詳細(xì)信息中的這樣的程序的結(jié)果。這就是所謂的黑暗或正相差?；?/span>相差顯微鏡配置的示意圖，在圖1中示出。

另一種可能的使用的情況少得多的，當(dāng)然，是安排減緩由1/4波長(zhǎng)，使直接光的衍射光和直射光到達(dá)目鏡在步驟建設(shè)性干涉。這種安排的結(jié)果在一個(gè)明亮的圖像較暗的背景上的標(biāo)本的細(xì)節(jié)，被稱為消極或鮮明的對(duì)比。

相差顯微鏡是非常成功的，并最終獲得了廣泛的應(yīng)用，從而在澤尼克獎(jiǎng)的prestigeous諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)于1953年。相差技術(shù)譽(yù)為顯微鏡在一個(gè)世紀(jì)的最偉大的進(jìn)步。相差，通過(guò)“轉(zhuǎn)換”相如生活材料為振幅標(biāo)本標(biāo)本，使科學(xué)家能夠看到細(xì)節(jié)未染色和/或生活對(duì)象與以前從未實(shí)現(xiàn)的清晰度和分辨率。

該的澤尼克方法涉及直接的零階光的衍射光在物鏡的后焦平面的分離。要做到這一點(diǎn)，一個(gè)環(huán)形環(huán)形帶被放置在正下方的下透鏡的聚光鏡，在聚光鏡的前焦平面，共軛的物鏡的后側(cè)焦點(diǎn)面。由于空心錐形從環(huán)形的光穿過(guò)試樣不偏離時(shí)，它到達(dá)上面的后側(cè)焦點(diǎn)面中的物鏡的形狀的光的環(huán)。微弱的光衍射標(biāo)本遍及整個(gè)后焦平面的客觀。

如果不允許的，因?yàn)檫@樣的組合，進(jìn)行目鏡的像面的衍射光將是約1/4波長(zhǎng)的直射光的背后。上面的圖像平面的衍射光的相位將是與直接光的相位，但其干擾的振幅幾乎相同的直射光。這將導(dǎo)致非常小的標(biāo)本的對(duì)比。

要加快直接不偏離零階光，安裝與連接到它上面的后側(cè)焦點(diǎn)面上的客觀的環(huán)形移相器的相位板。窄區(qū)域的相位差板的光學(xué)厚度比其余板塊。其結(jié)果是，不偏離的通過(guò)相環(huán)的光行進(jìn)在遍歷的物鏡比的衍射光的玻璃的更短的距離。

現(xiàn)在，當(dāng)直接的不偏離的光的衍射光進(jìn)入到像平面，它們是1/2波長(zhǎng)彼此同相。的衍射和直接光現(xiàn)在可以相消干涉，使試樣的細(xì)節(jié)出現(xiàn)暗對(duì)較亮的背景（就像他們做為吸收或幅度標(biāo)本）。這是一個(gè)描述發(fā)生的事情的在正面或暗相差。

如果環(huán)形移相器的相位板的面積比其余板塊厚，直接光的速度降低1/4波長(zhǎng)。在這種情況下，零級(jí)光到達(dá)在步驟（或同相）的衍射光的像面，并發(fā)生相長(zhǎng)干涉。較暗的背景上的圖像會(huì)出現(xiàn)明亮。圖像較暗的背景上出現(xiàn)亮點(diǎn)。這種類型的相差被描述為負(fù)或鮮明的對(duì)比。

因?yàn)椴黄x的光的零級(jí)比微弱的衍射光要亮得多，一個(gè)薄吸收透明金屬層沉積環(huán)上，帶來(lái)的直接和衍射光的強(qiáng)度成更好的平衡，以增加對(duì)比度。另外，因?yàn)榧涌旎蚍怕闹苯庸庥?jì)算的綠色光波長(zhǎng)的1/4，相圖像會(huì)出現(xiàn)一個(gè)綠色的過(guò)濾器時(shí)最好放置在光路（綠色干擾濾波器最好）。這樣一個(gè)綠色過(guò)濾器還可以幫助消色差物鏡產(chǎn)生最佳圖像，因?yàn)橄钔哥R球糾正綠燈的。

附件需要相差工作的一個(gè)臺(tái)下相差聚光鏡配備年輪相差物鏡和一組，每一個(gè)都有安裝的相位板。該聚光鏡通常具有與孔徑光闌和年輪的旋轉(zhuǎn)刀架的（不同放大倍率的各相物鏡，需要增加直徑的環(huán)形空間的物鏡的放大率增加）的明視場(chǎng)位置。每個(gè)階段的物鏡，有一個(gè)黑暗的環(huán)在其背部的鏡頭。這些物鏡也可用于普通明場(chǎng)透射光的工作，只有輕微的降低的圖像質(zhì)量。

相位裝的，由生產(chǎn)商提供的，通常包括綠色濾色器和一個(gè)相位望遠(yuǎn)鏡。后者是用來(lái)，使顯微鏡下車聚光鏡環(huán)環(huán)相板疊加到。臺(tái)下聚光定心螺釘?shù)囊唤M允許操縱該環(huán)形帶的對(duì)齊，同時(shí)觀察后焦平面相位望遠(yuǎn)鏡（或通過(guò)伯特蘭透鏡）中的物鏡。

設(shè)立一個(gè)相顯微鏡（臉頰襯里細(xì)胞是一種現(xiàn)成可用的測(cè)試材料），10X階段物鏡聚焦樣本。接下來(lái)，配置的科勒照明顯微鏡的使用明場(chǎng)（0）位置的聚光鏡。這是關(guān)鍵的步驟，以保證適當(dāng)對(duì)準(zhǔn)顯微鏡的物鏡，聚光鏡和視場(chǎng)光闌。正確對(duì)準(zhǔn)后顯微鏡，開拓聚光鏡光圈和搖擺炮塔聚光鏡到10的位置（這通常會(huì)自動(dòng)打開光圈）。將綠色過(guò)濾器在光路中，然后取出一個(gè)目鏡。插入相位望遠(yuǎn)鏡，同時(shí)觀察的物鏡的背面，使用為中心的環(huán)隙中心的環(huán)形帶的環(huán)板的螺絲。伯特蘭透鏡或針孔目鏡，如果有的話，將允許后焦平面的客觀的視圖。相環(huán)居中往往更容易做，如果試樣從光路被暫時(shí)移除。對(duì)齊后相環(huán)與環(huán)，重新插入目鏡和地點(diǎn)到適當(dāng)?shù)牡胤皆诠饴凤@微鏡舞臺(tái)上的標(biāo)本。

重復(fù)相同的步驟，為每個(gè)物鏡，確保炮塔旋轉(zhuǎn)，所以適當(dāng)?shù)南辔画h(huán)的定位是相匹配的物鏡放大倍率。一些制造商提供單個(gè)推入，定心，年輪，可以被插入到共同的阿貝聚光的下部。這種價(jià)格低廉，簡(jiǎn)單的設(shè)備做好與10X，20X和40X的階段物鏡，但只能接收一個(gè)聚光鏡一次。

顯微結(jié)構(gòu)的影響仍然是一種廣泛使用的重要工具，特別是對(duì)的顯微鏡研究生活和/或未染色的材料，如在培養(yǎng)的細(xì)胞和組織。的方法，目前也正在同時(shí)使用反射光的熒光不發(fā)出熒光的標(biāo)本揭示了區(qū)域。相顯微鏡技術(shù)是特別有用的與薄，分散在視場(chǎng)中的標(biāo)本。

相差顯微鏡有一些限制：

· 相圖像通常光暈所包圍的輪廓細(xì)節(jié)。這樣的暈光的文物，有時(shí)模糊的邊界細(xì)節(jié)。

· 相環(huán)空限制工作的光學(xué)系統(tǒng)的數(shù)值孔徑在一定程度上，從而降低分辨率。

· 相差不厚的標(biāo)本，因?yàn)樵诘诙A段的轉(zhuǎn)變發(fā)生略低于或略高于平面處于焦點(diǎn)地區(qū)。這種相移的形象混淆和歪曲的圖像細(xì)節(jié)。

· 如果使用白光和綠色，如果綠色過(guò)濾器是用來(lái)相圖像顯示為灰色。在過(guò)去，許多顯微鏡為黑色和白色相標(biāo)本進(jìn)行顯微攝影時(shí)限制他們的電影。今天，許多彩色膠片再現(xiàn)黑色，白色，和灰度非常有效，尤其是鎢均衡的透明膠片，富士，柯達(dá)，愛克發(fā)。

顯微結(jié)構(gòu)的影響是另一個(gè)例示的光在臺(tái)下聚光透鏡級(jí)較低的操作和上面的客觀的后側(cè)焦點(diǎn)面上的水平如何通過(guò)目鏡觀察到的圖像時(shí)，具有顯著的效果