全內(nèi)反射顯微鏡（TIRFM）是單分子熒光觀察用光學(xué)方法。有些生物物理學(xué)家已經(jīng)使用該技術(shù)多年，有的則是剛剛開始探索這種多功能的機制研究現(xiàn)象在接口的界限。

今天，技術(shù)日益普及與細胞生物學(xué)家和神經(jīng)科學(xué)家用它來觀察細胞膜熒光，部分是因為已經(jīng)開發(fā)了新的膜專用染料。在過去，全內(nèi)反射熒光顯微鏡難以執(zhí)行由于顯微鏡設(shè)置的復(fù)雜性，以及達到可接受的圖像的亮度的問題。本應(yīng)用筆記討論了最近開發(fā)的高數(shù)值孔徑顯微鏡物鏡，提高的TIRFM使得普及。

背景

全內(nèi)反射的一種光學(xué)現(xiàn)象，可以采用觀察的邊界處發(fā)生的事件。當(dāng)光照射兩個光的不同折射率的介質(zhì)之間的界面，在大于臨界角的角度入射的光進行全反射。

角以外的全反射，電磁場的輸入/反射光仍然到的z方向延伸。在此字段中的強度，通常被稱為漸逝波，呈指數(shù)下降，它的影響延伸到所述第二介質(zhì)（具有較低的折射率）只有幾百納米。內(nèi)試樣的漸逝場中的那部分可以被激發(fā)，發(fā)出熒光，因此可以看出或記錄。這是本質(zhì)的TIRFM（見圖1）。

全反射的條件由下面的公式給出：

θ(c) = sin-1(n(2)/n(1)) where n(1) > n(2)

其中，n（1）的物鏡的折射率，n（2）試樣的折射率，θ（c）的臨界角。這種情況是相同的，創(chuàng)建的倏逝波。

TIRFM的主要優(yōu)點是漸逝波的穿透深度淺。只有非常接近試樣表面的熒光分子受激發(fā)，創(chuàng)造一個非常薄的光學(xué)部分。漸逝場之外，熒光是最小的。（見圖2）效應(yīng)導(dǎo)致非常高的對比度，具有良好的信號噪聲比的圖像。

TIRFM儀器的光路

科學(xué)家已經(jīng)開發(fā)出一些TIRFM技術(shù)的設(shè)置，其中以下類型常見的有：（1）與照明側(cè)棱鏡，以及（2）通過透鏡照明（參見圖3）。

1.設(shè)置棱鏡。這種設(shè)置是很容易做到的，因為它需要顯微鏡，棱鏡，激光，所有的組件都是現(xiàn)成的。此安裝方法的缺點是，試樣之間的棱鏡和顯微鏡物鏡定位的要求。

2.安裝程序通過物鏡的照明。此安裝程序需要通過顯微鏡，激光被引入，并極大地受益于物鏡的數(shù)值孔徑（NA）> 1.4。試樣必須位于玻璃蓋的底表面上。制劑，面向遠離物鏡，訪問，允許使用其他的儀器，如顯微操作器，微分干涉對比（DIC）的照明光學(xué)系統(tǒng)，甚至掃描探針顯微鏡。

TIRFM物鏡

奧林巴斯APO 100x/NA 1.65復(fù)消色差物鏡（Olympus America Inc., Melville, NY）的數(shù)值孔徑大大超過以前最高的數(shù)值孔徑的物鏡，即Plan APO 100x/NA 1.4（奧林巴斯美國公司）?；罴毎ǔ＞哂械恼凵渎试?/span>1.33和1.38之間。要實現(xiàn)全內(nèi)反射，這樣的樣品必須被照射具有數(shù)值孔徑大于1.38（表1）。條件的上述和下述列出的方程表達的：

數(shù)值孔徑(NA) = n ? sin(θ)

其中，NA是物鏡的數(shù)值孔徑，n是折射率，θ是二分之一的物鏡孔徑角。

TIR角度和最大角度為物鏡

表1

激發(fā)光，必須通過通過鏡頭的大于1.38的數(shù)值孔徑錐部。使用一個高性能的平場復(fù)消色差1.4數(shù)值孔徑的物鏡，一個非常小的部分鏡頭數(shù)值孔徑（1.4 - 1.38 = 0.02）可以利用。雖然這是可能的，這是非常具有挑戰(zhàn)性的照明激光對準(zhǔn)。即使完美對齊，增加光的強度是困難的，因為微乎其微的數(shù)值孔徑保證金。很明顯，類似的APO 100x/1.65透鏡有更大的數(shù)值孔徑緯度（1.65 - 1.38 = 0.27），使其更容易引入的激發(fā)光通過物鏡出射光瞳（圖4和表1）。

為了維持的數(shù)值孔徑，并實現(xiàn)了圖像質(zhì)量的物鏡的能力，高折射率（浸沒液體[Cargille實驗室，雪松樹叢，NJ]：n（d）= 1.78），必須使用一種特殊的液浸介質(zhì)。（這是揮發(fā)性的，并應(yīng)處理使用好實驗室工業(yè)實踐）。

此外，玻璃蓋必須具有較高的折射率（n（d）= 1.788;奧林巴斯美國公司），但是其制造的非常低的音量使得它比較昂貴的。

其他應(yīng)用程序

該鏡頭具有其他應(yīng)用程序的好處。良好的近紅外傳輸，使得它非常有用激光捕獲（傳輸1064納米等于60％）。超分辨率DIC提供一個專門的棱鏡，利用在物鏡的數(shù)值孔徑。

熒光顯微鏡獲得了超過30％的強度的的數(shù)值孔徑100x/1.4客觀優(yōu)勢。全內(nèi)反射熒光顯微鏡，DIC，和標(biāo)準(zhǔn)的熒光顯微鏡的技術(shù)也可以結(jié)合。

組態(tài)

TIRFM作者的設(shè)置（表2和表3中給出的細節(jié)）使用IX70倒置顯微鏡（奧林巴斯美國公司），配備包括右側(cè)的的相機端口和IX激光端口。激光位于左側(cè)的顯微鏡。通過180毫米的的港口激光管透鏡的激光投影到出射光瞳的照明/成像透鏡（參見圖5）。

作為光源，20毫瓦的低噪聲固態(tài)激光器，發(fā)射532納米（激光，內(nèi)華達州里諾市的Crysta），被使用。氬氣，氦氣，氖氣，氪激光器也可以被使用，無論是直接地或通過光纖耦合。

用全反射熒光顯微術(shù)實現(xiàn)的有限的圖像強度，表明冷卻的黑白相機，如OLY-110，OLYMPIX 2000或MagnaFire（奧林巴斯美國公司）的使用。

樣品安裝IX70 TIRFM 
（從奧林巴斯美國公司的產(chǎn)品）

表2

推薦的第三方硬件/材料

表3

成像實驗

玻璃蓋，由0.2μm的熒光珠和四甲基若丹明異硫氰酸酯（TRITC）彩色面頰細胞的標(biāo)本制備的熒光圖像和全內(nèi)反射熒光顯微鏡圖像進行比較（參見圖6和7）。

在熒光模式下，集中在有孔玻璃珠，珠熒光是很難區(qū)分，因為從臉頰細胞的背景熒光遮蔽。在全內(nèi)反射熒光顯微鏡成像模式下，圖像的對比度顯著高的，有孔玻璃珠可以很容易地觀察到。

只有在近場（下面試樣側(cè)蓋玻片表面幾百納米）被激發(fā)。面頰細胞的倏逝波的到達，不利于熒光圖像。在其他實驗中，觀察DiI染色的Hela細胞和神經(jīng)元，熒光和全內(nèi)反射熒光顯微鏡進行了比較。在每一種情況下，全內(nèi)反射熒光顯微鏡允許非常高的對比度觀察細胞表面（圖8和9）。

結(jié)論

APO 100x/1.65是一個非常高的分辨率物鏡是提供TIRFM利息增加的時候。的物鏡，方便的IX70配置，相對經(jīng)濟的固態(tài)激光器的高數(shù)值孔徑帶來TIRFM技術(shù)顯微成像技術(shù)成為主流。的客觀與TIRFM中的應(yīng)用提供新的和令人興奮的調(diào)查研究界的機會。