徠卡顯微鏡:如何定義收集特定探頭發(fā)射的波段
由分束器或色散元件。來分隔多個(gè)排放量由它們的顏色,不同顏色的光,*引導(dǎo)到不同的空間方向,到達(dá)傳感器之前,引入帶通濾波器,以減少串音或刪除任何剩余激發(fā)光。經(jīng)典的,則此任務(wù)已離開共同的玻璃基帶通濾波器。***的設(shè)計(jì)使用光度計(jì)滑塊的多波段組件- SP的探測(cè)器。這個(gè)概念允許極其高效的感應(yīng)發(fā)射光,并同時(shí)提供了完整的可調(diào)諧。一個(gè)“副作用菜”選擇要錄制光譜掃描。有其他光譜的記錄裝置,根據(jù)由檢測(cè)元件的陣列的固定頻帶,但它們是不可調(diào)整的,較不敏感的。
圖 1:經(jīng)典的帶通濾波器的基礎(chǔ)上染色玻璃或干擾涂料。要更改的檢測(cè)頻帶,必須對(duì)過濾器進(jìn)行交換。這需要很多的過濾眼鏡和一個(gè)機(jī)動(dòng)的交換設(shè)備(?fotovika - Fotolia.com)。
多波段分光光度計(jì):SP探測(cè)器
從整個(gè)頻譜中選擇所需波段的一個(gè)完全不同的方法是使用機(jī)械裝置,折疊帶頻譜。如果光通過色散元件(棱鏡或光柵)中,組件的空間取決于他們的能量傳播。光子的能量對(duì)應(yīng)的顏色。在簡單的情況下,所得到的頻譜是一個(gè)白色的表面投影到可視化。很長一段時(shí)間,相紙被用于文檔和量化。如今,數(shù)字相機(jī)芯片實(shí)現(xiàn)光譜(分光器),用于查看和分析。
另外,也可以通過插入一個(gè)機(jī)械狹縫的白色表面的位置,并測(cè)量所傳輸?shù)哪芰?,選擇一個(gè)從整個(gè)頻譜的窄頻帶。的狹縫的位置可移到頻譜的能量分布(光譜儀)的位置的函數(shù),然后測(cè)量。
為了測(cè)量整個(gè)發(fā)光物種的能量,其特征是它的顏色,一個(gè)可以打開的狹縫中間處,使窗口覆蓋發(fā)射和拒絕其他部分的光譜。這樣的裝置,它具有帶通濾波器在中心頻率和帶寬的優(yōu)點(diǎn),可調(diào)諧性 - 它包括任何(單體),可以設(shè)計(jì)在給定的頻譜的帶濾波器的電勢(shì)。用適當(dāng)?shù)膫鞲衅鳎≒MT或路政署)相結(jié)合,這樣的設(shè)備是*通用的探測(cè)器共聚焦顯微鏡(*敏感的為好)。
正如到目前為止所描述的,這樣的頻帶光譜儀可以作為一個(gè)單通道實(shí)驗(yàn)。然而,現(xiàn)代的熒光在生物醫(yī)學(xué)研究需要同時(shí)記錄多個(gè)通道。巧妙地解決了這個(gè)任務(wù)的解決方案是通過級(jí)聯(lián)機(jī)械狹縫裝置。在這種多頻帶檢測(cè)系統(tǒng)(進(jìn)一步稱為“SP檢測(cè)器”),機(jī)械狹縫元素被表示為高反射鏡。的狹縫,將發(fā)送*信道所需的波長帶,但頻譜的其余部分被引導(dǎo),幾乎沒有損失,隨后,再次有反射鏡滑塊頻帶選擇的檢測(cè)器。從理論上講,一個(gè)無限數(shù)目這種級(jí)聯(lián)的頻帶探測(cè)器是可能的。對(duì)于現(xiàn)實(shí)的原因,目前器件具有多達(dá)5個(gè)傳感器。
這個(gè)概念的美是高效率(狹縫傳輸100%,反映99%)和獨(dú)立自由光譜可調(diào)諧的所有頻段。此外,每個(gè)通道都配有它自己的傳感器,允許獨(dú)立的電子放大和基線設(shè)置。
圖2:SP探測(cè)器采用高傳輸性能和白色玻璃棱鏡。被分離成頻帶的頻譜通過可動(dòng)反射鏡滑塊。這允許在任何可能的子集光譜,然后記錄,可作為檢測(cè)信道的頻譜被分割。
引入后的SP檢測(cè)器,以及其他的設(shè)計(jì)被出版,試圖匹配的多頻帶的方法的好處。其中之一采用陣列檢測(cè)器,通常多陽極的光譜投射到其上的光電倍增管。雖然這些設(shè)備有可能增加記錄的信號(hào)的數(shù)目,更簡單地說,它們具有顯著的缺點(diǎn):多陽極數(shù)組的使用減少由于分部必要的機(jī)械分離收集的光子。他們?cè)馐艿墓鈱W(xué)和電子串?dāng)_,他們沒有辦法提供單獨(dú)調(diào)整放大功率。本質(zhì)上是固定的頻帶,即不可調(diào)的,因此沒有適應(yīng)各種今天所使用的熒光染料的發(fā)射特性的影響 - 在今后不斷增加的復(fù)雜性的。設(shè)備不輸出信號(hào)被分配到各個(gè)排放種類,但只是固定的頻譜的分?jǐn)?shù)。因此,它們強(qiáng)制元分解算法,以獲得有意義的信道數(shù)據(jù)的裝置所記錄的數(shù)據(jù)的后處理。(配SP檢測(cè)器,信號(hào)分配給發(fā)射物種,解混一個(gè)選項(xiàng)來清除剩余的重疊在這里)。 陣列檢測(cè)器也強(qiáng)制要求的發(fā)射光譜線性色散。因此,采用棱鏡陣列檢測(cè)器的系統(tǒng)中是不可能的。出于這個(gè)原因,光柵被使用,它在性能上有重大的缺點(diǎn)。光柵沒有平面(白)輸出,但發(fā)揮*大閃耀波長。因此被低估更長和更短的波長收集的數(shù)據(jù)。光柵也強(qiáng)烈依賴于偏振的,非偏振光的(這是典型的生物熒光發(fā)射)的效率降低約50%-70%(于表現(xiàn)*好的顏色)。已作出嘗試修復(fù)這個(gè)缺陷與額外的光學(xué)元件。光柵的第三個(gè)問題是輸入能量的事實(shí),不僅在一個(gè)單一的光譜,也可進(jìn)入第 0 階和高階的光分散,釋放。這就降低了整體的效率,在所有光柵。在這里,已經(jīng)引入了附加的光學(xué)裝置,為了解決這個(gè)問題。 在這些設(shè)備都是基于記錄光譜的想法。然而:不需要熒光成像光譜進(jìn)行記錄,非常罕見的情況下除外。低效獲得的光譜需要重新計(jì)算提供有意義染料信息。SP探測(cè)器不會(huì)受到高階損失,也不偏振依賴性。它提供了完全可調(diào)的檢測(cè)帶,個(gè)別放大。它允許線性分解的情況下,這是有益的, -作為一個(gè)額外的好處-它可以記錄在高分辨率光譜。 圖 3:單獨(dú)的點(diǎn)式探測(cè)器(SP檢測(cè)器)允許調(diào)整樣品中的各種染料的排放量中的動(dòng)態(tài)差異。檢測(cè)窗口可調(diào)的動(dòng)態(tài)范圍是單獨(dú)的適應(yīng)性(多陽極陣列解決方案相反)。其他的方法
玻璃過濾器
在過去,熒光顯微鏡,幾乎總是配備玻璃屏障過濾器過濾器。非常早期的熒光顯微鏡透射系統(tǒng)建成,也就是說,它們?cè)谕干涔庀虏僮鳌?/span>這種技術(shù)完全取代落射光束路徑(入射光)。入射光的系統(tǒng)有一個(gè)更好的激發(fā)和發(fā)射的分離,這是一項(xiàng)重要的要求,作為熒光的光只有約10 -4 10 -10倍的照明。屏障過濾器必須滿足兩個(gè)任務(wù):*,盡可能阻止盡可能多的寄生光(剩余激發(fā)光路徑達(dá)到檢測(cè)樣品中由于反射或光學(xué)元件)。其次,阻擋過濾器是用來進(jìn)一步縮小所收集的色頻帶的信道信號(hào),以提高特異性,如果樣品中含有多個(gè)熒光物種(減少串?dāng)_)。
玻璃過濾器可以由染色玻璃材料,這是可以在許多不同的顏色。然而,染色玻璃的性能取決于所使用的化合物,沒有選項(xiàng)設(shè)計(jì)以外的各種化學(xué)品的混合,接近所需的傳輸特性的光譜特性。設(shè)計(jì)更加靈活,是基于干涉效應(yīng)的多層膜沉積在透明玻璃的過濾器。這種涂層提供的選項(xiàng)設(shè)計(jì)更多或更少的任何可見光譜內(nèi)的帶通。更復(fù)雜的涂料可以作為多頻帶過濾器,具有三個(gè)或四個(gè)波段的傳輸與反射部分之間,允許多個(gè)激發(fā)和檢測(cè)。
雖然*的多層鍍膜技術(shù)上*,此類設(shè)備的限制是他們的intunability。以服務(wù)為眾多的染料和染料組合,一個(gè)系統(tǒng)必須配備這種過濾器具有將被插入到光束路徑根據(jù)需要,通過手動(dòng)或電動(dòng)操作的集合。這使得基于過濾器的系統(tǒng)非常靈活,慢慢適應(yīng)。