在熒光顯微鏡應(yīng)用中通常采用的各種機(jī)制限制熒光團(tuán)的激發(fā)和檢測(cè)的樣品的薄區(qū)域。 消除從焦平面以外的背景熒光，顯著提高的信號(hào)噪聲比，并因此，空間分辨率的功能或感興趣的事件。 全內(nèi)反射熒光顯微鏡（TIRF）利用感應(yīng)的倏逝波或場(chǎng)的有限的試樣區(qū)域，緊鄰兩個(gè)具有不同折射率的介質(zhì)之間的界面的**性能。 在實(shí)踐中，*常用的接口在應(yīng)用程序中的全內(nèi)反射螢光顯微鏡的試樣和玻璃蓋玻片或組織培養(yǎng)容器之間的接觸面積。

TIRFM的基本概念并不是新的，和*近的興趣和熱情，技術(shù)已經(jīng)到來(lái)，由于技術(shù)進(jìn)步，促進(jìn)其使用。 可用的完整的準(zhǔn)備使用的儀器儀表系統(tǒng)的方法，以及在熒光基團(tuán)的技術(shù)，比如基因編碼的熒光物種，發(fā)展就業(yè)使人們有可能在直接調(diào)查細(xì)胞膜和其它表面處理的數(shù)這在以前是不可能的方式。

TIRFM的物理基礎(chǔ)

全內(nèi)反射（TIR）的物理現(xiàn)象已依賴在這種看似不同應(yīng)用現(xiàn)代光纖的數(shù)據(jù)傳輸，并在百年歷史的鉆石切割利用率提高，切割的寶石閃閃發(fā)光，或“火”。 在每一種情況下，光的折射（或彎曲），當(dāng)它遇到禁閉的一部分或全部的光的高折射率介質(zhì)具有不同折射率的兩種介質(zhì)之間的界面（n）的結(jié)果。 甲準(zhǔn)直光束通過(guò)一種介質(zhì)傳播，達(dá)到這樣的接口可以是折射的，因?yàn)樗M(jìn)入第二介質(zhì)的界面處反射，取決于入射角，并在兩種介質(zhì)的折射率的差異。 全內(nèi)反射是*可能的情況下，在其中傳播的光遇到低的折射率的介質(zhì)的邊界。 其屈光的行為是由斯涅耳定律：

n(1)×SINθ(1)=n(2)×SINθ(2)

其中，n（1）較高的折射率和n（2）的折射率低。 ，相對(duì)于界面法線與入射光束的角度θ（1）表示的，而折射光束角由下式給出θ（2）內(nèi)的低折射率介質(zhì)。 當(dāng)光照射該接口的兩種材料在足夠高的角度，稱為臨界角（θ（c）），它的折射方向成為平行接口（相對(duì)于法線90度），它被反射在較大的角度完全返回到*介質(zhì)。

雖然光不再傳遞到所述第二介質(zhì)中時(shí)，它是在大于臨界角的角度入射時(shí)，反射光產(chǎn)生一個(gè)高度受限制的電磁場(chǎng)的界面附近，在較低折射率的介質(zhì)中。 這漸逝場(chǎng)對(duì)入射光的頻率是相同的，因?yàn)樗趶?qiáng)度與界面的距離呈指數(shù)衰減，該字段在*多幾百納米到試樣在z方向 （垂直接口）延伸。 在一個(gè)典型的實(shí)驗(yàn)裝置中，在液體的玻璃或塑料液體表面附近的熒光基團(tuán)，分布可以激發(fā)出的漸逝場(chǎng)，只要它們有潛在的電子躍遷的能量范圍內(nèi)或非常接近的照明光束的波長(zhǎng)帶寬。 由于漸逝場(chǎng)強(qiáng)度呈指數(shù)衰減，熒光團(tuán)的激發(fā)是受限制的區(qū)域，這是典型的，厚度小于100納米。 通過(guò)比較，該光學(xué)部分的厚度是約十分之一，所產(chǎn)生的共焦熒光顯微技術(shù)。 避免因?yàn)榇罅康脑嚇拥臒晒鈭F(tuán)的激發(fā)，次級(jí)熒光發(fā)射限制到一個(gè)非常薄的區(qū)域，來(lái)實(shí)現(xiàn)高得多的信號(hào)對(duì)噪聲比較傳統(tǒng)的寬視場(chǎng)落射熒光照明。 這種增強(qiáng)的信號(hào)電平，使得它可以通過(guò)內(nèi)全反射螢光顯微方法檢測(cè)單分子熒光。

全內(nèi)反射熒光的基本概念，是示意性地示出在圖1中，試樣的細(xì)胞結(jié)合的熒光分子（圖中的綠色的熒光基團(tuán)），其中在玻璃顯微鏡載片上的支持。 在載玻片試樣介質(zhì)水溶液（約1.35）（1.518）的折射率適當(dāng)?shù)刂С秩珒?nèi)反射，在玻璃載片上。 調(diào)整激光激發(fā)的值大于臨界角的入射角，照射光束被完全反射回時(shí)遇到的接口到顯微鏡載片上，緊接該接口相鄰的檢體介質(zhì)中產(chǎn)生漸逝場(chǎng)。 *接近的玻璃表面的熒光基團(tuán)被選擇性地激發(fā)的相互作用的漸逝場(chǎng)中，可以收集從這些發(fā)射器的二次熒光顯微鏡的光學(xué)系統(tǒng)。

正如先前所討論的，所采取的不同介質(zhì)之間的界面處的折射或反射后傳播的光束的角度取決于光的入射角的界面處，以及這兩種材料的折射率。 發(fā)病率，*過(guò)該發(fā)生全內(nèi)反射的臨界角，可以計(jì)算由斯涅耳定律的表達(dá)操縱，上面給出的。 應(yīng)用方程細(xì)胞膜的過(guò)程的一個(gè)典型的生物調(diào)查，載玻片或蓋玻片的折射率由n（1）（約1.5）表示，而n（2）表示的折射率的緩沖水溶液或細(xì)胞質(zhì)組件（1.33至1.38）。 具有n（1）比n（2），當(dāng)θ（1）*過(guò)臨界角θ（三），會(huì)發(fā)生全內(nèi)反射在玻璃介質(zhì)。 上面的臨界入射角，折射發(fā)生在90度（罪θ（2）=1），斯涅耳定律簡(jiǎn)化為：

n（1）×SINθ（C）= n（2）

或

SINθ（C）=n(2)/ n（1）

因此，在臨界角可以表示為：

θ（C）=sin^-1 N（2）/ N（1）

不突然發(fā)生全內(nèi)反射的臨界角成為一種新現(xiàn)象，但隨后用少量的反射，*過(guò)臨界角時(shí)，總反射從主導(dǎo)折射的連續(xù)過(guò)渡。 朝著臨界角值隨著入射角的增大，傳輸（折射）光束反射光束強(qiáng)度減弱，而變得更加**。 在所有大于臨界角的角度，總的內(nèi)部反射來(lái)實(shí)現(xiàn)，其中基本上所有的光被反射回所述*介質(zhì)。 即使不再光傳播到所述第二介質(zhì)中，有少量的反射光通過(guò)該接口，然后平行于表面的傳播，創(chuàng)建一個(gè)電磁場(chǎng)在緊接該接口相鄰的第二介質(zhì)的滲透。 這個(gè)字段是被稱為漸逝場(chǎng)，并在有限的界面附近的區(qū)域，它是能夠令人興奮的熒光基團(tuán)。 在z方向上（垂直于界面）的指數(shù)衰減的倏逝波的能量激勵(lì)的范圍是有限的。 下面的公式定義這種能量的距離的函數(shù)，從該接口：

E（Z）= E（0）exp（-z/d）

其中，E（z）是在從接口的垂直距離 z和E的能量（0）是在界面處的能量。 的穿透深度（d）不依賴于入射照明光的波長(zhǎng)（λ（i））的入射角，和在界面處的折射率的介質(zhì)，根據(jù)公式：

在小的入射角，通過(guò)該接口的較低折射率介質(zhì)傳播的光波的正弦，有一個(gè)特征周期。 在增加角度，接近臨界值，這個(gè)時(shí)期的折射光線變長(zhǎng)，變得更接近平行于界面的傳播方向。 當(dāng)達(dá)到臨界角，波周期變得無(wú)限大，折射光的波陣面垂直于界面的表面對(duì)齊。

要總結(jié)，有幾個(gè)關(guān)鍵因素支配的倏逝波在顯微鏡的利用率。 全內(nèi)反射的發(fā)生，并且產(chǎn)生的漸逝場(chǎng)中的照明發(fā)病率的介質(zhì)的折射率必須是大于檢體介質(zhì)（比n（2），N（1）），光的入射角（θ （1））必須是大于臨界角（θ（c） ）。 入射照明光波長(zhǎng)的影響倏逝波的穿透深度和特定的被激發(fā)的熒光基團(tuán)，其中必須有適當(dāng)?shù)奈仗匦缘?a title='光源' target='_blank' class='seolabel'>光源的波長(zhǎng)帶中。 的含意結(jié)合的倏逝波的能量呈指數(shù)下降的事實(shí)，在z方向上的波長(zhǎng)的影響，可以誘導(dǎo)在一個(gè)非常薄的光學(xué)部分，通常小于100納米的厚度，高度特異性熒光激發(fā)。 盡管是有限的全內(nèi)反射螢光顯微鏡成像具有合適的折射率的兩種不同介質(zhì)的界面處，大量的應(yīng)用是非常適合的技術(shù)。 在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究興趣是*活躍的領(lǐng)域之一，其中許多引人注目的問題涉及過(guò)程發(fā)生在細(xì)胞表面或血漿膜 - 適當(dāng)?shù)慕涌赥IRFM調(diào)查。

TIRFM基本儀器的方法

有兩種基本的方法配置儀器的全內(nèi)反射熒光顯微鏡：棱鏡法 ，和物鏡方法 。 圖2說(shuō)明了這兩個(gè)配置。 在棱鏡技術(shù)，聚焦的激光束被引入到顯微鏡蓋玻片通過(guò)附在其表面上的棱鏡，光束入射角被調(diào)整到臨界角（參見圖2（a））。 依賴引進(jìn)光束在棱鏡有許多限制，主要是由于到標(biāo)本操縱的幾何約束，盡管該方法在生物應(yīng)用已動(dòng)用*過(guò)二十年，它從來(lái)就沒有成為一個(gè)主流研究工具。 棱鏡配置有許多變化，但大多數(shù)限制訪問試樣，使其難以執(zhí)行操作，注入介質(zhì)入檢體空間，或進(jìn)行生理測(cè)量。

棱鏡技術(shù)的另一個(gè)缺點(diǎn)是倒置顯微鏡設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，在大多數(shù)配置中，被引入的照明在試件上的相反側(cè)的目標(biāo)的光學(xué)元件，需要通過(guò)大量的試樣的漸逝場(chǎng)區(qū)域成像。 放置棱鏡的標(biāo)本，以避免這種情況的客觀方面提出更多的問題，因?yàn)榭拷粋€(gè)短工作距離目標(biāo)的標(biāo)本和棱鏡位置。配置利用全內(nèi)反射成像系統(tǒng)的復(fù)雜性和精度要求阻礙了許多潛在的研究人員從顯微鏡制造商提供完整的系統(tǒng)（“交鑰匙”）成為前。 需要調(diào)查誰(shuí)想要利用技術(shù)，設(shè)計(jì)并建立自己的系統(tǒng)，這個(gè)困難，結(jié)合的必要性，建立和維護(hù)一個(gè)開放的激光光學(xué)平臺(tái)上，這意味著更早版本的用戶更經(jīng)常棱鏡方法物理學(xué)家比生物學(xué)家。

所述物鏡的技術(shù)，它有時(shí)也被稱為通過(guò)透鏡照明 ，避免了許多設(shè)計(jì)上的限制，利用這樣的棱鏡引入光在所要求的角度（參見圖2（b））。 在該方法中，客觀上介紹無(wú)論是相干激光或蓋玻片試樣界面的非相干弧燈照明。 的入射角大于臨界角的實(shí)現(xiàn)通過(guò)使用高數(shù)值孔徑的目標(biāo)（理想情況下為1.45或更高）。 通常情況下，被認(rèn)為是一個(gè)客觀的數(shù)值孔徑的特征的光收集能力的鏡頭。 相反，直接的數(shù)值孔徑?jīng)Q定的角度范圍內(nèi)的光可以退出該目標(biāo)時(shí)，它是利用一個(gè)提供照明。 數(shù)值孔徑和可實(shí)現(xiàn)的照明的入射角之間的關(guān)系由下面的公式描述：

數(shù)值孔徑（NA）= n×sin（θ）

其中，NA是物鏡的數(shù)值孔徑，n表示折射率，θ是二分之一的物鏡的孔徑角。 結(jié)合上面給出的全內(nèi)反射條件的關(guān)系，示出該活細(xì)胞具有典型的折射率為1.38需要一個(gè)客觀的，具有大于1.38的數(shù)值孔徑，以實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射的照明。 光線進(jìn)入的目標(biāo)必須通過(guò)的孔徑錐部對(duì)應(yīng)于數(shù)值孔徑大于1.38的值，以上面的玻璃試樣界面被全反射。 如果采用相干激光照明，它必須集中在目標(biāo)后孔的周邊，保證燈將退出上面的角度等于或大于臨界值的前面的光學(xué)表面。 在非相干照明，例如以從一個(gè)弧放電燈的情況下，在一個(gè)不透明的磁盤的形式的掩模必須被引入到光路中，以限制的目標(biāo)的光通過(guò)后孔的外部區(qū)域。

通過(guò)限制在物鏡的后焦平面的圓形環(huán)隙區(qū)域的照明，照明錐的中心的光線，通常會(huì)出現(xiàn)在亞臨界角被擋。 由此產(chǎn)生的排放物的目標(biāo)是一個(gè)中空的圓錐體入射的光的后半的角度足以造成全內(nèi)反射的TIR接口。 如果顯著的照明的目標(biāo)后孔（較低的數(shù)值孔徑區(qū)域）的中央部通過(guò)，落射照明，而不是全內(nèi)反射，降低在圖像平面上的信號(hào) - 噪聲比。 在實(shí)踐中，不透明的阻光磁盤可以被安裝在一個(gè)可移動(dòng)的滑塊，促進(jìn)TIRF和落射照明成像模式之間快速切換。

實(shí)現(xiàn)漸逝場(chǎng)激發(fā)通過(guò)使用高孔徑物鏡，在試樣的操作和測(cè)量選項(xiàng)提供了更大的靈活性比棱鏡為基礎(chǔ)的技術(shù)，但入射照明角度的精確控制是比較困難的。 當(dāng)一激光源，用于耦合到棱鏡的光的入射的角度可以很容易地在很寬的范圍內(nèi)變化，可以簡(jiǎn)單的控制的漸逝場(chǎng)的穿透深度。 與物鏡系統(tǒng)，在客觀的后側(cè)焦點(diǎn)面上的激光的聚焦點(diǎn)的偏軸（利用的開口的外周部），和從透鏡軸的徑向距離增加，產(chǎn)生一個(gè)相應(yīng)的角度的增加，在光入射到試樣上的（參見圖3）。

如果物鏡的數(shù)值孔徑足夠大，則可以實(shí)現(xiàn)全內(nèi)反射的臨界角。 ，因?yàn)橹饕募?xì)胞成分（細(xì)胞質(zhì)中）具有約1.38的折射率，物鏡的數(shù)值孔徑*過(guò)該值是必需的。 只有百分之幾的鏡頭的周邊區(qū)域有一個(gè)1.4的數(shù)值孔徑的目標(biāo)，可以利用全內(nèi)反射的臨界角的只能稍微*過(guò)，進(jìn)入后孔的一個(gè)非常具有挑戰(zhàn)性的程序耦合的激光。 顯然，更高的數(shù)值孔徑的目標(biāo)是有利的，并提供額外營(yíng)運(yùn)利潤(rùn)率*過(guò)臨界角的角度微調(diào)。 一旦*過(guò)臨界角時(shí)，鏡頭的光軸的激光焦點(diǎn)的徑向距離的進(jìn)一步增加，以減少在一個(gè)光滑的和可重復(fù)的方式漸逝場(chǎng)的穿透深度。

TIRFM應(yīng)用

在一般情況下，總的內(nèi)部反射照明具有潛在的好處，在任何應(yīng)用程序需要標(biāo)本中有大量的熒光基團(tuán)位于分子在溶液中的布朗運(yùn)動(dòng)的興趣愛好，如光學(xué)平面以外的微小結(jié)構(gòu)或單分子成像，囊泡發(fā)生內(nèi)吞作用胞吐，或單細(xì)胞蛋白質(zhì)販運(yùn)。 這樣的樣本通常表現(xiàn)出急劇增加，信號(hào)噪聲比的限制，激發(fā)區(qū)域的厚度。 圖4表示的利用TIRFM技術(shù)方法（圖4（b））和常規(guī)落射熒光照明（圖圖4（d））的溶液的熒光微球獲得的圖像。 到左邊的每個(gè)圖像是其對(duì)應(yīng)的的強(qiáng)度直方圖（圖4（a）和圖4（c））。 在影像中，在尖銳的本地化和較高的信號(hào)強(qiáng)度在直方圖中對(duì)應(yīng)的全內(nèi)反射螢光顯微鏡圖像（圖球體從1.3到35所提供的信號(hào)-噪聲比（S / N）增加分辨率的提高是明顯的圖4（a））。

人們很早就認(rèn)識(shí)到，全內(nèi)反射螢光顯微鏡在回答了一些生物的問題可能會(huì)成為一個(gè)**的工具，雖然使用了20多年，該技術(shù)已得到了相當(dāng)多的關(guān)注，直到*近。 電池基板接觸人體皮膚成纖維細(xì)胞，標(biāo)記用熒光血脂，TIRFM在20世紀(jì)80年代初進(jìn)行了調(diào)查。 在大約相同的時(shí)間利用TIRFM技術(shù)的組合進(jìn)行的另一項(xiàng)研究中，用熒光漂白恢復(fù)（FRAP）澄清生物分子的表面動(dòng)力學(xué)，同時(shí)仍然集中在綁定到表面的能量轉(zhuǎn)移的牛血清白蛋白。 結(jié)合，后者的研究的TIRFM與熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET），另一種技術(shù)，目前正經(jīng)歷著快速增長(zhǎng)的應(yīng)用程序。

TIRFM和其他**技術(shù)更多地利用的趨勢(shì)是由于供應(yīng)量增加，使得它不必要的工程師，為每個(gè)特定的研究應(yīng)用，并構(gòu)建定制系統(tǒng)*的模塊化儀器。 另一個(gè)重要因素是，可以適用于各種各樣的問題，其中*重要的，這可能是利用綠色熒光蛋白（GFP），青色，藍(lán)色，黃色和紅色的衍生物的多功能生物工具的發(fā)展。 來(lái)源于水母的綠色熒光蛋白，不要求種屬特異的輔助因子表達(dá)和展覽的熒光，可用于跨物種實(shí)驗(yàn)。 生物的熒光基團(tuán)已被插入到數(shù)百蛋白質(zhì)，通過(guò)基因重組，并且本質(zhì)上是無(wú)限的，潛在的。 另一個(gè)有希望的GFP突變體的發(fā)展能力的結(jié)果作為神經(jīng)遞質(zhì)釋放過(guò)程中的細(xì)胞內(nèi)鈣指標(biāo)的功能。 這些蛋白質(zhì)已監(jiān)測(cè)在一些研究中，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移。

TIRFM是一個(gè)理想的工具，進(jìn)行調(diào)查的機(jī)制和動(dòng)力，許多參與細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用的蛋白質(zhì)。圖5給出比較圖像的活細(xì)胞（PtK1袋鼠腎上皮細(xì)胞表達(dá)GFP-紐）利用傳統(tǒng)的廣角落射熒光法（圖5（A））和漸逝波照明（圖5（b））。 TIRFM圖像顯示融合蛋白在細(xì)胞粘著斑由平面熒光落射照明圖像產(chǎn)生模糊的巨大反差的是在襯底界面的本地化。 活細(xì)胞成像代表TIRFM技術(shù)*有前途的應(yīng)用之一。 蛋白在細(xì)胞膜表面的相互作用，如涉及焦點(diǎn)粘連，它具有極大的重要性，在細(xì)胞生物學(xué)。 理解正常的細(xì)胞生長(zhǎng)和其衰減造成的細(xì)胞 - 細(xì)胞接觸（接觸抑制）中所涉及的信號(hào)可以提供異常細(xì)胞的生長(zhǎng)中發(fā)生的疾病，如癌癥的洞察。

生物分子水平的，全內(nèi)反射螢光顯微鏡技術(shù)已被用于圖像的突變蛋白的GFP-消旋販賣沿薄絲狀偽足的細(xì)胞生長(zhǎng)在基板上（圖6）的單分子。 這種蛋白是參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，其在細(xì)胞膜的相互作用的動(dòng)力學(xué)的知識(shí)是至關(guān)重要的了解的過(guò)程。 有足夠的時(shí)間分辨率動(dòng)態(tài)研究的可視化單分子熒光TIRFM，因?yàn)閼叶礇Q的倏逝波激發(fā)所帶來(lái)的信號(hào)噪聲比。 圖6給出的四個(gè)連續(xù)時(shí)間的推移在200毫秒的時(shí)間間隔拍攝的幀，示出了運(yùn)動(dòng)的GFP-Rac的融合蛋白分子（箭頭）通過(guò)細(xì)filopodium的一個(gè)爪蟾的細(xì)胞生長(zhǎng)在襯底上。

TIRFM雖然是有限的調(diào)查蓋玻片標(biāo)本接口或附近發(fā)生的結(jié)構(gòu)和流程，它是目前在生物和生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的興趣，很多問題可以探討在細(xì)胞膜同時(shí)偶然。 神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的許多根本問題借給自己TIRF顯微鏡研究。 應(yīng)用該技術(shù)的一個(gè)理想的候選人是在突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和吸收的研究。 從歷史上看，膜販運(yùn)和融合的機(jī)制，包括突觸囊泡釋放（胞吐）或攝取（內(nèi)吞作用），已使用遺傳，生化，電子顯微方法研究。 這些技術(shù)在某些方面是間接的，或僅提供一個(gè)瞬時(shí)表示所發(fā)生的程序，無(wú)法解析的細(xì)胞膜活性的復(fù)雜動(dòng)態(tài)。

膜片鉗技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)允許電容測(cè)量可用來(lái)指示，由非常小的電變化，膜表面積或氧化物質(zhì)的釋放的加法或減法。 這種技術(shù)的缺點(diǎn)是，只有融合事件被檢測(cè)到，和高時(shí)間分辨率的同時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)，有很少的重要事件的空間位置上的信息。 由于所有的事件一起被檢測(cè)到，得到無(wú)特異性和囊泡運(yùn)輸對(duì)接，和膜融合的其他階段的細(xì)節(jié)通常被結(jié)合動(dòng)力學(xué)模型推斷，從小區(qū)的測(cè)量。 雖然電子顯微鏡調(diào)查提供了出色的空間分辨率，活細(xì)胞或動(dòng)態(tài)的研究是不可能的，與其他測(cè)量瞬時(shí)意見的相關(guān)性是非常困難的。 強(qiáng)度的TIRFM方法，證明在*近的調(diào)查中，可能是直接肉眼觀察動(dòng)態(tài)囊泡蛋白相互作用。

TIRFM由于個(gè)別囊泡光學(xué)解決，按照它們之間的相互作用，直接動(dòng)態(tài)的能力，提供了*的大量的蛋白質(zhì)參與的方式在神經(jīng)生物學(xué)過(guò)程研究的能力。 *近的一項(xiàng)研究表明釋放的熒光脂質(zhì)含有突觸船只活動(dòng)區(qū)域，以及隨后從儲(chǔ)備庫(kù)位于20納米從質(zhì)膜提供補(bǔ)充盜號(hào)木馬的囊泡運(yùn)輸?shù)摹?/span> 另一項(xiàng)研究涉及直接可視化培養(yǎng)的肥大細(xì)胞的內(nèi)吞作用的動(dòng)態(tài)過(guò)程中肌動(dòng)蛋白的作用。 GFP-肌動(dòng)蛋白絲，觀察周圍的熒光標(biāo)記的胞飲囊泡，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白的流中拉出。 一時(shí)間推移TIRFM成像序列圖7說(shuō)明GFP-肌動(dòng)蛋白的內(nèi)吞過(guò)程中。 的6個(gè)連續(xù)的幀表示在0到65秒的范圍內(nèi)的不同的時(shí)間間隔。 在每個(gè)幀中的白色箭頭表示的GFP-肌動(dòng)蛋白的融合蛋白的信號(hào)。

在圖8中示出的多光譜成像囊泡-肌動(dòng)蛋白的內(nèi)吞作用過(guò)程中的相互作用。 在這兩個(gè)通道的圖像（圖8（a）），一個(gè)流的綠色標(biāo)記的GFP - 肌動(dòng)蛋白被認(rèn)為是在細(xì)胞外介質(zhì)中的囊泡含有德克薩斯紅葡聚糖周圍。 一時(shí)間的推移三個(gè)雙通道圖像序列（圖8（b）至8（d）條）提供了洞察時(shí)間動(dòng)態(tài)的肌動(dòng)蛋白囊泡的胞飲過(guò)程中的互動(dòng)。 這種類型的研究邏輯上可以擴(kuò)展標(biāo)記突觸蛋白，利用不同的GFP顏色的變種，以調(diào)查他們的互動(dòng)和動(dòng)態(tài)。

雖然試樣中的全內(nèi)反射螢光顯微鏡中成像在二維空間中，有可以得到在細(xì)胞的囊泡或結(jié)構(gòu)上的位置的三維信息的機(jī)制，其中，無(wú)論是在活細(xì)胞研究和在固定染色制劑。 圖9示出了在細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白的微管蛋白的免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)記，想像同時(shí)使用寬視場(chǎng)落射熒光（圖9（a））和瞬逝波照射（圖9（b））。 結(jié)構(gòu)的細(xì)節(jié)揭示在TIRFM技術(shù)的圖像，不能進(jìn)行可視化與常規(guī)落射照明。 比較兩個(gè)圖像模式所強(qiáng)調(diào)的是覆蓋在偽。 在圖9中（C），螢光分配的顏色為綠色，而TIRFM圖像顯示為紅色。

全內(nèi)反射螢光顯微鏡的原理，通過(guò)改變照明的入射角，并因此對(duì)倏逝波的穿透深度，熒光基團(tuán)可以被區(qū)分納米尺度上的深度。 這種技術(shù)可以精確地控制穿透深度更容易棱鏡類型的系統(tǒng)中來(lái)完成的，*近的技術(shù)改進(jìn)的方法是利用聲-光偏轉(zhuǎn)器（AOD），快速地改變?nèi)肷浣恰?/span> 在漸逝場(chǎng)深度的快速變化，目標(biāo)囊泡或其他結(jié)構(gòu)可以跟蹤在不同的深度和準(zhǔn)確地確定它們的位置。有很多方向AOD中的全內(nèi)反射螢光顯微鏡，包括用作極快的快門，可以快速地調(diào)節(jié)照明波長(zhǎng)的多線式激光裝系統(tǒng)的潛在的有用的應(yīng)用程序。

如上所討論的，在目標(biāo)為基礎(chǔ)的系統(tǒng)中的入射角的變化是不容易在使用棱鏡來(lái)完成，雖然新的更高的數(shù)值孔徑的目標(biāo)提供了相當(dāng)大的改進(jìn)，在可用的范圍內(nèi)的入射角調(diào)整。 在一般情況下，目標(biāo)類型的系統(tǒng)能夠檢測(cè)更多的發(fā)射光，并且這個(gè)信號(hào)的強(qiáng)度隨距離單調(diào)減小。 該屬性是一個(gè)優(yōu)勢(shì)，在校準(zhǔn)的TIRFM技術(shù)的系統(tǒng)，可以使熒光信號(hào)電平有關(guān)的軸向位置，提供了另一種方法，三維成像。

未來(lái)發(fā)展前景

TIRFM的基本理論，現(xiàn)在成立，*近的技術(shù)進(jìn)步大大促進(jìn)了該技術(shù)已實(shí)際執(zhí)行。 因此，越來(lái)越多的生物分子和細(xì)胞生物學(xué)的調(diào)查正在使用的技術(shù)進(jìn)行。 TIRFM技術(shù)的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上直立或倒置顯微鏡是相對(duì)簡(jiǎn)單的，使用的激光光源，并且可以通過(guò)使用傳統(tǒng)的弧燈源，如果進(jìn)行了修改，以阻止光通過(guò)的中央?yún)^(qū)域的目標(biāo)。 TIRFM配置與其他光學(xué)技術(shù)結(jié)合，完整的模塊化顯微鏡系統(tǒng)，現(xiàn)在，有的廠家專門為內(nèi)部反射的應(yīng)用提供了高數(shù)值孔徑物鏡。 具有廣泛的照明模式，包括明，暗場(chǎng)，相襯和微分干涉對(duì)比，以及常規(guī)落射熒光的內(nèi)全反射螢光顯微技術(shù)兼容。 的目標(biāo)為基礎(chǔ)的系統(tǒng)的一個(gè)特別的優(yōu)點(diǎn)是，它們可以被用來(lái)結(jié)合用于處理生物分子的各種機(jī)制，如原子力顯微鏡。 它很可能是全內(nèi)反射螢光顯微鏡將繼續(xù)被合并與其他技術(shù)互補(bǔ)。

收購(gòu)在活細(xì)胞在多個(gè)波長(zhǎng)的高時(shí)空分辨率的圖像數(shù)據(jù)是一個(gè)面積的TIRFM大有希望，一定要更詳細(xì)地比以前一直未能揭示細(xì)胞動(dòng)力學(xué)和擴(kuò)大利用各種染料組合。 *近，研究者已經(jīng)報(bào)道利用雙發(fā)射波長(zhǎng)檢測(cè)，可以在一個(gè)單一的波長(zhǎng)激發(fā)的熒光基團(tuán)，并通過(guò)配置系統(tǒng)的多波長(zhǎng)激發(fā)TIRFM能力進(jìn)一步擴(kuò)大的可能性是存在的。 單分子研究，將大大提高染料特性的進(jìn)一步發(fā)展和持續(xù)改進(jìn)的探測(cè)器。 在細(xì)胞研究的TIRFM方法的擴(kuò)展可能繼續(xù)通過(guò)細(xì)化的遺傳和分子操縱技術(shù)，結(jié)合所提供倏逝波激發(fā)的高時(shí)空分辨率的光學(xué)檢測(cè)。

TIRFM和激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM）由于有一定的通用功能，這兩種技術(shù)進(jìn)行評(píng)估時(shí)，自然比較可能的方法來(lái)研究問題。 雖然這兩種技術(shù)提供了光學(xué)切片能力，全內(nèi)反射螢光顯微鏡的方法是有限的試樣區(qū)域，具有一個(gè)合適的折射率界面，而共聚焦顯微鏡可以選擇性圖像幾乎任何試樣平面。 然而，共聚焦方法所產(chǎn)生的*小的光學(xué)部分的厚度是約600納米 - 厚度大于100納米的部分的內(nèi)全反射螢光顯微技術(shù)的典型。 在許多應(yīng)用中，它是希望到標(biāo)本（減輕細(xì)胞損傷，例如），以盡量減少總的照明通量，因?yàn)楣簿劢构ぞ哒樟烈粋€(gè)比較大的標(biāo)本量，這是與全內(nèi)反射螢光顯微鏡更容易地完成。 在一般情況下，它是更經(jīng)濟(jì)的配置TIRFM技術(shù)的儀器，它不需要復(fù)雜的掃描系統(tǒng)，可以建在幾乎任何現(xiàn)代光學(xué)顯微鏡研究級(jí)。 完整的，配置系統(tǒng)的一些廠家所提供的是*直接的進(jìn)入點(diǎn)TIRFM技術(shù)，并允許其他**的光學(xué)成像模式的綜合能力。

d = λ(i)/4π × (n(1)²sin²θ(1) - n(2)²)^-1/2