徠卡顯微鏡，CARS和共聚焦
由于激光共聚焦顯微鏡的問世，科學(xué)家們已經(jīng)獲得了導(dǎo)致生命如何工作有更深的了解了許多新的見解。 單光子和多光子共焦顯微術(shù)的*重要的缺點是需要來標(biāo)記樣品。 CARS（相干反斯托克斯拉曼光譜法）解決了這個問題，因為它是無毒的，非破壞性的，微創(chuàng)
染色過程有約束：染料漂白隨著時間的推移，可以是光毒性，并可能影響后續(xù)的研究方法和偽裝隨后的研究信息。 過程與彩色樣品不適合長期分析：大氣條件的破壞染料和染料改變時，在與空氣或濕氣接觸 - 任何變化的環(huán)境條件會影響試驗結(jié)果。 另外，染色過程非常耗時。 有些樣品不能被污染可言，因為染料的熒光團或存在的連接改變了分子或生物體的功能。
相干反斯托克斯拉曼光譜 - 技術(shù)
CARS是一個三階非線性過程，涉及到一個泵浦光束在可濕性粉劑和斯托克斯束的WS的一個頻率的頻率。 試樣是通過波混頻過程的刺激。 反斯托克斯信號πas=2πp-ΠS是相匹配的方向，在頻差振動產(chǎn)生相反Δν= VSP-與泵浦光與斯托克斯梁之間。 這等于振動的特定化學(xué)鍵的能量的頻率。
圖1：CARS能量圖
圖2：在霜，覆蓋圖像脂滴的偏差。 綠色背景顯示的水（在3150厘米-1收購），而紅點是脂肪成分（在2850厘米-1收購）。
活分子分析與CARS
CARS顯微鏡的主要應(yīng)用被發(fā)現(xiàn)在生物，制藥和皮膚病研究，生物醫(yī)學(xué)成像，食品加工和材料科學(xué)。 其潛力已被證明對各種生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，如脂質(zhì)轉(zhuǎn)運的成像，蛋白濃度，DNA，RNA，組織在活的生物體，并且為了在液晶。 通過集成CARS技術(shù)融入現(xiàn)代光學(xué)掃描顯微鏡系統(tǒng)中，研究人員擁有*新的技術(shù)在手加上一個易于使用的共聚焦系統(tǒng)。
高分辨率圖像
圖 3：小鼠耳（*大投影）的皮膚，在2849厘米-1拉曼位移（對應(yīng)于CH 2的伸縮振動）。 教授Sunney謝，化學(xué)系和化學(xué)生物學(xué)，哈佛大學(xué)，劍橋大學(xué)，美國的禮貌
傳統(tǒng)的掃描儀是用于形態(tài)學(xué)研究優(yōu)化在大腦和皮膚，或亞細胞成像功能，如細胞骨架。 它允許每個圖像采樣高達8,196×8,196像素，結(jié)合來看高分辨率大視場。 此外，掃描器的速度可以適應(yīng)從400赫茲到2800赫茲在雙向模式。
在皮膚表面，對應(yīng)的毛發(fā)與色球長的細絲可以看到一個非常強烈的信號，因為毛發(fā)覆蓋著油。 在皮膚表面，一個明亮的多邊形圖案輪廓形成的皮膚的*上層時，角質(zhì)層的角質(zhì)細胞。 起因于細胞間隙富含脂質(zhì)，膽固醇，神經(jīng)酰胺和信號。 在第二層中，周圍的毛發(fā)根部明亮的結(jié)構(gòu)被檢測到，皮脂腺。 他們是擠滿了包含甘油三酯和蠟酯皮脂水庫多細胞車廂。 在70-80微米表面的細胞，脂肪細胞，含有豐富的脂肪，被發(fā)現(xiàn)在真皮層。 因為CARS信號只在焦點處產(chǎn)生的三維成像能力被示為具有*大的突起。
CARS在視頻速率
共振掃描器提供了緊湊的設(shè)計和快速的畫面記錄的好處。 當(dāng)基于點照明和點觀測的真實共聚焦的概念，共振掃描器允許在雙向模式16,000赫茲頻率的速度。 在512×512像素的幀大小時，系統(tǒng)獲得每秒29圖象。 以較低的采樣，速度可以提高到512×32個像素的分辨率，以每秒290幀。 高時間分辨率的動態(tài)過程進行成像和測量或線掃描可以采取全速率。
施加平均提高了信號的信噪比，這在諧振掃描儀的情況下特別有用。 它有可能找到的圖像質(zhì)量和采集速度之間的正確折衷，根據(jù)成像要求。 在專業(yè)設(shè)計的共焦共振掃描器的幅度是可調(diào)的，這使得它可以通過施加較小的振幅進行放大。 有了這個功能，可以集中到感興趣的區(qū)域，而在收購視頻率圖像。 泛函數(shù) - 另一個有用的設(shè)備迅速轉(zhuǎn)移到有趣的地方，這不一定是在微觀領(lǐng)域的中心 - 也應(yīng)該是可與共振掃描儀。
隨后CARS顯微鏡開辟了新的途徑，以可視化的基礎(chǔ)上固有振動特性的結(jié)構(gòu)不染色或標(biāo)記的標(biāo)本。 試樣不從擾動由染料或光致漂白受損。 CARS打開了新的研究方法，尤其是在細胞生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，皮膚科，以及醫(yī)療成像。
圖4：這些CARS圖片顯示小鼠皮膚的皮下脂肪層的富含脂質(zhì)的脂肪細胞。 左邊的圖像是采取共振掃描儀的全速，采集圖像以29張/秒的雙向模式的速度，即在視頻速率。 在120納秒像素的停留時間只有幾輛車光子被檢測到，從而在嘈雜的形象。 右邊的圖像對應(yīng)于平均與諧振掃描器接管30的圖像，即，對應(yīng)于非諧振掃描儀的圖像質(zhì)量。 教授Sunney謝，化學(xué)系和化學(xué)生物學(xué)，哈佛大學(xué)，劍橋大學(xué)，美國的禮貌
使CARS顯微鏡訪問
化學(xué)系的Andreas Zumbusch教授，德國Konstanz大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的一個研究小組對物理化學(xué)。 他專注于單分子熒光光譜和顯微技術(shù)，以及對非線性光學(xué)顯微鏡的開發(fā)與應(yīng)用：“許多研究領(lǐng)域，無論是從生命科學(xué)和材料科學(xué)的背景下，需要快速，非侵入性的成像具有高空間高分辨率，高分子特異性和靈敏度高。正如它的對比度是內(nèi)在的樣品光譜特性的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的一種光學(xué)方法，CARS顯微鏡可以提供這一切。在神經(jīng)科學(xué)，例如，CARS顯微鏡可以產(chǎn)生影響比得上雙光子顯微鏡，不同之處在于它不依賴于引入的熒光標(biāo)記物。
商業(yè)CARS顯微鏡系統(tǒng)的出現(xiàn)無疑是朝著使該技術(shù)訪問感興趣的研究人員在其應(yīng)用程序中的重要一步。 有吸引力的系統(tǒng)概念提供離手操作，同時允許被使用的CARS顯微鏡的全部潛力“。
圖 5：一只老鼠耳未染色的皮膚。 Sebacouce腺體多細胞車廂，其中包含甘油三酯和蠟酯。 由于它們的CH 2鍵結(jié)，脂肪成分可以**成像和CARS及導(dǎo)致銳利，清晰的成像效果。 教授Sunney謝，化學(xué)系和化學(xué)生物學(xué)，哈佛大學(xué)，劍橋大學(xué)，美國的禮貌
圖6：小鼠尾巴成像labelfree與外延車的橫截面（反射光，紅色區(qū)域）和F-SHG（透射光，綠色區(qū)域）相結(jié)合的大約脂質(zhì)和試樣的結(jié)構(gòu)性質(zhì)的信息。