分辨率在光學(xué)顯微鏡通常由光學(xué)單元稱為瑞利判據(jù)，它最初是制定確定的二維望遠(yuǎn)鏡的圖像分辨率的方法進(jìn)行評(píng)估，但已蔓延到在光學(xué)許多其他領(lǐng)域。

瑞利準(zhǔn)則是在光從樣本生成的，并且是不依賴于用于產(chǎn)生所述圖像的放大率兩個(gè)點(diǎn)源之間的最小可分辨的距離來(lái)定義。 在一個(gè)二維圖像，兩個(gè)點(diǎn)源是可解析的，如果他們的艾里斑的衍射圖案是不同的。 根據(jù)瑞利準(zhǔn)則，兩個(gè)緊密間隔的艾里磁盤(pán)是不同的，如果他們是距離大于在其中的一個(gè)艾里斑的主要最大值與該第一最小值，第二艾里斑（如圖1所示）相一致的距離。 如果該點(diǎn)光源是相等的波長(zhǎng)的話，他們的艾里盤(pán)具有相同的直徑，并瑞利準(zhǔn)則就等于一個(gè)艾里斑的半徑，從它的點(diǎn)的最大強(qiáng)度的測(cè)量，以最小強(qiáng)度的第一環(huán)。 對(duì)于給定的熒光波長(zhǎng)的單色圖像，瑞利判據(jù)可以使用在許多光學(xué)和顯微鏡教科書(shū)中的標(biāo)準(zhǔn)公式進(jìn)行估算：

其中d是瑞利準(zhǔn)則，λ是發(fā)射光的波長(zhǎng)，NA是物鏡的數(shù)值孔徑。 請(qǐng)注意，d值越小，分辨率越高。

如圖1所示，是在數(shù)學(xué)上由光的兩個(gè)點(diǎn)源產(chǎn)生的光強(qiáng)度分布（藍(lán)線）。 該配置文件可以被認(rèn)為是通過(guò)艾里斑（實(shí)際上，在焦點(diǎn)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的xy圖像）來(lái)表示像素強(qiáng)度沿一條線。 時(shí)的1點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的最大強(qiáng)度的第一極小的另一個(gè)重疊的瑞利準(zhǔn)則進(jìn)行解析得到滿足。 對(duì)于兩點(diǎn)發(fā)射在同一波長(zhǎng)，此間隔距離對(duì)應(yīng)于一個(gè)單一的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中央亮區(qū)域的半徑（或峰的最小距離）。

上面概述的分辨率公式是用于評(píng)估在圖像平面分辨率有用的，但不沿光軸的顯微鏡，信息是成功的分析通過(guò)反卷積技術(shù)關(guān)鍵（z軸）。 然而，適當(dāng)?shù)墓接糜谳S向瑞利準(zhǔn)則可以使用類似的推理來(lái)推導(dǎo)。 當(dāng)他們的軸向衍射圖案是不同會(huì)產(chǎn)生光的兩個(gè)點(diǎn)源之間的最小可分辨軸向距離。 這是通過(guò)一個(gè)事實(shí)，即一個(gè)點(diǎn)源的軸向衍射圖案不是圓盤(pán)狀，但具有沙漏形狀的點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的圖像的光斑或在xz或YZ平面復(fù)雜。 然而，這種沙漏形狀有一個(gè)明亮的中心區(qū)域，一樣的艾里斑。 因此，軸向瑞利準(zhǔn)則可以通過(guò)利用從最大強(qiáng)度的點(diǎn)的距離，以沿著z軸方向的中央亮區(qū)域的最小強(qiáng)度的第一點(diǎn)來(lái)定義。 這個(gè)值可以使用下面的公式來(lái)估算：

注意，公式包括η，所述安裝/浸沒(méi)介質(zhì)的折射率，在分子中。 安裝和浸沒(méi)介質(zhì)被假定具有相同的折射率，否則，球面像差導(dǎo)致的分辨率的降低。 讀者也應(yīng)該注意，所有的討論的標(biāo)準(zhǔn)假設(shè)無(wú)像差的成像條件下，一種不切實(shí)際的方案在實(shí)踐中。 上面列出的軸向分辨率方程的仔細(xì)研究表明，降低了液浸介質(zhì)的折射率可以提高Z軸分辨率。 然而，這種情況不會(huì)發(fā)生，因?yàn)槲镧R的數(shù)值孔徑（也取決于折射率值）被引入具有低的折射率的成像介質(zhì)時(shí)降低。 因?yàn)檩S向分辨率隨數(shù)值孔徑的平方，在物鏡的數(shù)值孔徑的減少遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)通過(guò)減少在成像介質(zhì)的折射率來(lái)實(shí)現(xiàn)的增益和分辨率受到損害。 通知還在xy平面中的分辨率而變化僅與數(shù)值孔徑的第一電源，而軸向（或z軸）的分辨率與數(shù)值孔徑的平方而變化。 這個(gè)重要的區(qū)別意味著，XY分辨率和z軸分辨率都與增加數(shù)值孔徑提高，但Z軸分辨率更可顯著提高。

Z-分辨率是密切相關(guān)但不完全相同的景深的概念。 景深是經(jīng)典定義為標(biāo)本，在焦點(diǎn)顯微鏡的特定焦點(diǎn)設(shè)置出現(xiàn)在最終圖像的厚度區(qū)域。 當(dāng)檢查的二維圖像中，試樣的某一部分被聚焦到一個(gè)單一的平面。 出現(xiàn)同樣的作用聚焦在圖像中的功能可駐留在樣品的不同深度。 焦點(diǎn)的定義是有些主觀，但是字段“單元”的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)深度通常被定義為一半軸向瑞利單元：

這是偶爾使用，而不是在軸向瑞利準(zhǔn)則另一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)是在點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的中央亮區(qū)的半最大值（FWHM）的整個(gè)寬度。 公式估算全寬半值在共聚焦顯微鏡中出現(xiàn)幾個(gè)顯微鏡評(píng)價(jià)和是相同的，上述的瑞利準(zhǔn)則在寬視場(chǎng)顯微鏡。 應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，這些都是粗糙的表情，讓實(shí)際的估計(jì)。 它們不是嚴(yán)格的分析公式，這需要矢量波理論。

還應(yīng)當(dāng)理解的是，任何分辨率的標(biāo)準(zhǔn)是不分解的絕對(duì)指標(biāo)，而是任意的標(biāo)準(zhǔn)是用于比較不同的成像條件是有用的。 瑞利準(zhǔn)則特別適用于其中兩個(gè)自發(fā)光的物體必須區(qū)分開(kāi)來(lái)的情況。 在其他情況下，如微分干涉對(duì)比（DIC），明場(chǎng)，暗場(chǎng)或顯微鏡，其他條件都將適用。 在一些應(yīng)用中，如移動(dòng)物體的定位，下面的瑞利極限分辨率是可能的。 這凸顯了一個(gè)事實(shí)，即分辨率是任務(wù)相關(guān)的，不能隨意定義適用于所有情況。

另外，分辨率也取決于在很大的程度上圖像的對(duì)比度，或?qū)谋尘皡^(qū)分樣品產(chǎn)生的信號(hào)的能力。 相反在很大程度上取決于諸如固定品質(zhì)，抗?jié)B透，染色均勻度，熒光褪色，和背景熒光樣品制備技術(shù)。 優(yōu)化的試樣制備方法，可以更為顯著，并以較低的成本比光學(xué)或計(jì)算機(jī)提高分辨率。 然而，假設(shè)一個(gè)高質(zhì)量的制劑，適用于任何應(yīng)用的分辨率的限制總是依賴于點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)和瑞利準(zhǔn)則產(chǎn)生至少在該值的大小的基本處理。

分辨率和對(duì)比度的改進(jìn)

內(nèi)時(shí)其解卷積算法是基于原則的框架，它是合理的質(zhì)疑的圖像質(zhì)量何種程度的定量的改進(jìn)可以從迭代解卷積可以預(yù)料的，以及如何最好地評(píng)估和比較各種算法的性能。 作出這種評(píng)估的一種方法是測(cè)量的大小和亮度，前后反褶積，已知大小的測(cè)試對(duì)象。 圖2給出了從一個(gè)subresolution（0.1微米）與利用油浸物鏡（1.4數(shù)值孔徑）一個(gè)寬視場(chǎng)成像系統(tǒng)中獲取的熒光珠的圖像堆棧數(shù)據(jù)。 所有像差進(jìn)行了仔細(xì)最小化數(shù)據(jù)收集之前，并且因?yàn)橛须x焦的沒(méi)有從任何其他對(duì)象信號(hào)，該微小珠子代表一個(gè)接近理想的樣本用于此目的。

在圖2中，黃線表示的原始圖像數(shù)據(jù)，而紅色線表示由受約束的迭代解卷積恢復(fù)從圖像數(shù)據(jù)。 為了結(jié)垢特性圖中，各強(qiáng)度值已被歸一化到其自身的圖像堆棧的最大值。 如果沒(méi)有這樣的歸一化，從原始圖像數(shù)據(jù)也只是勉強(qiáng)地是在圖上可見(jiàn)，因?yàn)榻裹c(diǎn)像素強(qiáng)度是如此的亮得多的恢復(fù)圖像比原始圖像。 每個(gè)圖像堆棧的總積分強(qiáng)度，但是，在這兩種情況下是相同的。

量化的迭代解卷積來(lái)實(shí)現(xiàn)分辨率的提高，像素強(qiáng)度測(cè)定在平行于光軸的線穿過(guò)胎圈的中心，前后恢復(fù)。 每個(gè)像素的強(qiáng)度進(jìn)行作圖（圖2（a）），歸一化后，如沿z軸從胎圈（0微米）的中心的距離的函數(shù)。 于z軸的強(qiáng)度分布的半最大值（FWHM）處的全寬度取為胎圈的直徑，并測(cè)量0.7微米中的原始圖像和0.45微米的恢復(fù)圖像（實(shí)際的對(duì)象測(cè)量0.1微米）。 由于這個(gè)恢復(fù)溫和增長(zhǎng)的分辨率只會(huì)很少露出一個(gè)生物標(biāo)本結(jié)構(gòu)，這不是在原始圖像中可見(jiàn)。

從恢復(fù)所產(chǎn)生的圖像中的一個(gè)主要的變化是明顯的，在圖2所示的數(shù)據(jù)（b）中，它表示所有的像素值中的每個(gè)焦平面的總和（積分像素強(qiáng)度）為焦點(diǎn)深度的函數(shù)。 對(duì)應(yīng)于原始數(shù)據(jù)的曲線（在處理之前）示出了顯著外的聚焦強(qiáng)度在距胎圈2微米的距離。 恢復(fù)迭代反卷積轉(zhuǎn)移大部分失焦的強(qiáng)度恢復(fù)到局灶性起源的飛機(jī)。 其結(jié)果是在圖像的對(duì)比度顯著改善，使其更容易解決和圖像中的辨別特征。 在繪制該數(shù)據(jù)，在原料和恢復(fù)圖像棧的每個(gè)焦平面上的像素相加的強(qiáng)度進(jìn)行歸一化到平面的圖像堆棧的最大值和最小值。 求和強(qiáng)度繪制為焦點(diǎn)（Z軸）從胎圈中心（0微米）的距離的函數(shù)。 信號(hào)強(qiáng)度從外的焦點(diǎn)樣品體積在焦恢復(fù)到產(chǎn)生主要對(duì)比度改進(jìn)，以及增加了信號(hào) - 噪聲比。 應(yīng)當(dāng)注意，然而，在整個(gè)圖像的積分強(qiáng)度（實(shí)際上，各平面的求和強(qiáng)度之和）是在原料和恢復(fù)的圖像是相同的。

前面的討論概括評(píng)估的迭代解卷積算法的性能的一種手段。 的許多可用測(cè)定其中的算法，產(chǎn)生最佳的恢復(fù)帶來(lái)了另外一個(gè)問(wèn)題了顯微鏡。 一些網(wǎng)站的應(yīng)用比較不同算法的結(jié)果，但這種比較可以被誤導(dǎo)的原因有多種。首先，算法通常由執(zhí)行這些還原合成的球形物體，如用來(lái)收集在圖2中給出的數(shù)據(jù)，或理論的對(duì)象甚至計(jì)算機(jī)生成的圖像的珠的圖像進(jìn)行比較。 性能之間的關(guān)系，評(píng)價(jià)利用測(cè)試對(duì)象和與實(shí)際生物標(biāo)本表現(xiàn)并不簡(jiǎn)單。 此外，除非該比較是定量進(jìn)行，與已知大小的物體，這是難以評(píng)估更賞心悅目結(jié)果是否確實(shí)更準(zhǔn)確。 例如，該算法可能侵蝕的特征的邊緣，這使它們更清晰，但混雜測(cè)量。

另外一個(gè)問(wèn)題是，算法的比較，通常由出版方有興趣（通常金融）的比較，這使得它們潛在偏見(jiàn)的結(jié)果。 通常情況下，這些政黨比較反卷積算法，其實(shí)現(xiàn)他們已經(jīng)開(kāi)發(fā)和完善多年，具有即在其最根本的形式實(shí)現(xiàn)非優(yōu)化算法，最初發(fā)表。 然而，如前面所討論的，在速度，穩(wěn)定性和分辨率的改善大的差異可以歸因于一個(gè)算法的實(shí)現(xiàn)和優(yōu)化的細(xì)節(jié)。 因此，唯一公平的比較是認(rèn)識(shí)軟件包之間，而不是基本的算法之間。

強(qiáng)烈建議去卷積軟件的任何潛在買(mǎi)家比較對(duì)自己數(shù)據(jù)的各種軟件包的性能。 這可能需要一定程度的確定，因?yàn)樵S多公司的銷售代表將定期保存圖像的一種專有的文件格式，它往往不能被競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手所開(kāi)'的軟件。 為了比較不同的軟件包復(fù)原后的圖像，有必要做出一定的圖像保存在一個(gè)共識(shí)文件格式。 目前與最廣泛流通的格式是一個(gè)堆棧中的標(biāo)記的圖像文件格式（TIFF）的順序編號(hào)的文件，每個(gè)代表該三維圖像的焦平面（未突起）。 優(yōu)選的是，有一組可以由各種軟件包被評(píng)估被處理示例圖像文件和點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的文件。 采用的算法的評(píng)價(jià)自己的圖像和點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于，特定的樣品制備方案中，目標(biāo)，放大，噪聲電平，信號(hào)強(qiáng)度，球面像差的存在程度，和其他變量會(huì)影響反褶積的質(zhì)量極大。

電腦速度和內(nèi)存使用情況

越來(lái)越多的計(jì)算機(jī)處理器速度，安裝的隨機(jī)存取存儲(chǔ)器（RAM），和總線速度的量都增加卷積速度的手段。在去卷積，一個(gè)數(shù)字，代表不同形式的圖像的大數(shù)據(jù)陣列被同時(shí)存儲(chǔ)在RAM中，并通過(guò)總線周?chē)苿?dòng)的計(jì)算機(jī)內(nèi)。 其結(jié)果是，RAM的容量是用于三維圖像的快速處理關(guān)鍵的，因?yàn)槭强偩€速度。 作為一個(gè)經(jīng)驗(yàn)法則，圖像處理計(jì)算機(jī)應(yīng)配備至少3倍的RAM作為被去卷積的圖像的大小。 此外，具有快速總線速度的計(jì)算機(jī)性能要好得多，即使名義上較慢的中央處理器。

圖像文件的大小通常報(bào)告的計(jì)算機(jī)的操作系統(tǒng)。 然而，如果這是毋庸置疑的，大小可通過(guò)像素的圖像中的總數(shù)量由每像素的字節(jié)數(shù)（被稱為位深度 ）來(lái)計(jì)算。 本機(jī)的位深度的圖像的原本由數(shù)字成像捕捉系統(tǒng)，它可以產(chǎn)生每像素8，10，12，或16比特置位。 一旦圖像被獲取時(shí)，位深度由軟件包和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)（; 8比特等于1個(gè)字節(jié)，這是幾乎總是8位或16位）來(lái)確定。 在彩色圖像中，每種顏色必須被單獨(dú)存儲(chǔ)和去卷積，所以必須小心，以確定比特深度的完整圖像，而不是僅僅為一個(gè)顏色通道。 該計(jì)算是如本例所示：三維圖像的堆棧，其中每個(gè)面是512×512個(gè)像素，含64的光學(xué)面，用三種顏色的每像素8位（或每像素1字節(jié)）測(cè)量512×512的×64×3×1 = 50兆字節(jié)（MB）。 圖像文件頭數(shù)據(jù)可能略有增加這個(gè)計(jì)算大小。