徠卡 LMD6000 和徠卡 LMD7000 的激光顯微切割系統(tǒng)被用于解剖的特定單元格、 單元格人口和微觀組織塊不同的植物，如Dilatris物種 （Haemodoraceae） ，挪威云杉 （松科云杉冷杉，金絲桃屬植物物種 （Hypericaceae），油菜十字花科植物甘藍(lán)型油菜L.）， Colquhounia 黑老虎變種翅果油樹(shù)（唇形）和******（次生） 。LMD 程序，LMD (A)，(B)、 激光顯微切割技術(shù)術(shù)后樣品處理 (C) 和 (D) 有針對(duì)性的植物次生代謝產(chǎn)物的分析樣品制備的一般工作流程是所示，討論了為每個(gè)樣品 （表 1）。介紹了相同或類(lèi)似的方法在只有一次詳細(xì)介紹. 

作為一種工具 LMD 收獲從分泌腔Dilatris pillansii巴克， Dilatris 銅錘Berg 的樹(shù)葉。和Dilatris 桑子L.

從新鮮的Dilatris組織分泌腔

Haemodoraceae、 Strelitziaceae、 科類(lèi)、 芭蕉科植物家庭共同有次生代謝產(chǎn)物，稱(chēng)為 phenylphenalenones一組。屬Dilatris是 phenylphenalenones 的唯一已知擁有內(nèi)部分泌腔 （SC），其略帶紅色的顏色建議在場(chǎng)的 Haemodoraceae 家庭的成員。使用研磨方法淺表 SC 提取盾狀腺毛的唇形的一些成員已成功；不過(guò)準(zhǔn)確地從周?chē)慕M織，從而使它們的內(nèi)容的植物化學(xué)成分分析分離 SC 的內(nèi)部供應(yīng)鏈的外科解剖帶來(lái)新的挑戰(zhàn)

(A） 在第一種方法，新鮮的葉子， d。pillansii被切成小塊，然后被嵌在組織凍結(jié)媒體和液態(tài)氮冷凍的管理單元。作為有機(jī)溶劑的化學(xué)脫水植物組織中的石蠟包埋的過(guò)程，和使用這可以損害 LMD 樣品完全失去了 SC 的橙色彩色內(nèi)容的結(jié)果，超低溫 (在攝氏-25 o C） 被認(rèn)為更適當(dāng)為 LMD 準(zhǔn)備組織樣本。冷凍的葉碎片是用切片機(jī)切和被安置在一張幻燈片上。

(B） 厚度的 60 μ m 被證明是最好的解剖腺上皮細(xì)胞的 SC 和其分泌的存儲(chǔ)空間。在一個(gè)單一的運(yùn)行的激光很多時(shí)候?qū)崿F(xiàn)這一點(diǎn)。只有少數(shù)幾例觀察泄漏和這些 SC 因此而被丟棄。高粘度的植物化學(xué)成分含量的 SC 固定，后者到玻璃幻燈片。25 孤立的 SC 因此被鋒利的解剖針體視顯微鏡下的玻璃幻燈片從挑選。

(C） 術(shù)后樣本治療包括提取丙酮： 水 （20： 1） 與次生代謝產(chǎn)物的混合物和去除細(xì)胞碎片用離心機(jī)。上清液直接轉(zhuǎn)移到新鮮的微細(xì)管，在氮?dú)庀聲窀伞?/span>

(D)殘留進(jìn)行了再在氘代溶劑中溶解和分析反相液相色譜法和低溫1H 核磁共振 （NMR） 技術(shù)。比較確定了兩個(gè)主要和次要的 phenylphenalenone1H 核磁共振譜和 LMD 樣品的高效液相色譜-與參考化合物。檢測(cè)到 phenylphenalenones 的相對(duì)比例積分的比例所選擇確定1H NMR 信號(hào)。糖苷 phenylphenalenones 沒(méi)有建議 SC 是親脂性的隔間。

從Dilatris 植物標(biāo)本室組織分泌腔

我們開(kāi)發(fā)了一種新的方法來(lái)解剖 180 歲 SC 的葉子和內(nèi)、 外花被片在標(biāo)本 （專(zhuān)為D.桑子和D.銅錘標(biāo)本)。作為從D.反對(duì)在新鮮葉片的材料的供應(yīng)鏈pillansii、 植物標(biāo)本室材料的 SC 未涵蓋的周?chē)悩?gòu)細(xì)胞從所有兩側(cè)

(A） A 專(zhuān)門(mén)制造金屬框架結(jié)合允許修復(fù) SC 位于整個(gè)樣品的薄玻璃片。

(B） 二十 SC 收獲了使用 LMD。

(C） 觀察神經(jīng)纖維材料的收集使用重力微管的蓋子，然后直接轉(zhuǎn)給了核磁共振管不離心。

(D） 增加了 Deuterated 溶劑和混合了造影 1 分鐘。采用低溫提取的植物代謝物測(cè)定1H 核磁共振波譜法。一個(gè) phenylphenalenone 被確定比較1H 核磁共振譜與那些正宗的參考。Phenylphenalenone 在 SC 的這兩個(gè)新鮮植物材料和超過(guò) 180 歲標(biāo)本的檢測(cè)證明了這種植物次生代謝物的長(zhǎng)期穩(wěn)定性。

LMD 作為一種工具來(lái)探索挪威云杉（歐洲云杉)樹(shù)皮的植物化學(xué)組分

石細(xì)胞

挪威云杉（歐洲云杉）是最豐富的針葉樹(shù)物種在歐亞大陸的北方和溫帶森林。這種生態(tài)和經(jīng)濟(jì)的重要康年綜合數(shù)組的化學(xué)防御化合物，如松脂、 單聲道、 倍半和二萜類(lèi)化合物和多元酚類(lèi)物質(zhì)，作為植物次生代謝產(chǎn)物參與防御病原體和草食動(dòng)物包括苯乙烯、 苯丙素類(lèi)、 黃酮類(lèi)化合物的粘性混合物。很多的出版物處理過(guò)的防衛(wèi)作用的松脂少也，以解決多酚，這是由 Schiebe et al. 調(diào)查的焦點(diǎn)的作用。LMD 和低溫核磁共振波譜法的組合被用于石細(xì)胞 (石細(xì)胞) 挪威云杉樹(shù)皮 （圖 1） 中的微量化學(xué)分析。兩種酚類(lèi)化合物，二苯乙烯 astringin 和黃烷酮醇 dihydroxyquercetin 3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷被確定的核磁共振譜的提取與那些引用和 MS 數(shù)據(jù)的比較.

(A)樹(shù)皮塊取樣從不同高度 （5 米、 15 米和 20 米） 的樹(shù)木在室外生長(zhǎng)。一個(gè)新鮮的剃須刀片用于切割材料縱向在離地面 1.5 米的高度。冰冷卻帶被運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室和嵌入在組織冰凍介質(zhì)和立即用液態(tài)氮冷凍，然后保持在-20 ° c。碎片然后在-20 ° C 到 30 毫米厚片 cryosectioned，安裝在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡載玻片，朝下節(jié)把它們放在一個(gè)徠卡 AS LMD 系統(tǒng)上。

(B)石細(xì)胞能從周?chē)捻g皮部細(xì)胞熒光模式排放 515 nm dicroic 鏡子 510 nm 勵(lì)磁 450 — — 490 nm） 的區(qū)別。激光觀察神經(jīng)纖維材料收集中的微量離心管帽的重力。兩到三天有必要，每個(gè)樣本的消費(fèi)稅。多余冷凍介質(zhì)存在排除在外的石細(xì)胞向邊緣部分的集合。后 2 h 的收集，微細(xì)管已從 LMD 系統(tǒng)，避免過(guò)度變暖的采集的植物材料通過(guò)顯微鏡燈。

(C)離心法微圓管內(nèi)允許使用的材料在容器的底部上定居。在含硅凝膠在黑暗中在 4 o C 48 小時(shí)的薄層色譜法儲(chǔ)罐進(jìn)行了物料的干燥。溫和條件提供徹底干燥，并最小化殘差 HDO 信號(hào)中的核磁共振譜。

(D)提取被執(zhí)行在核磁共振管中，向其中添加的植物材料和氘代的甲醇和緊接其后的造影為 5 分鐘1H-NMR，1H-1H 舒適和 HSQC 譜錄得兩種酚類(lèi)化合物的測(cè)定 （astringin 和 dihydroxyquercetin 3'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，如上文所述）。蘆丁是作為一種內(nèi)部的標(biāo)準(zhǔn)用于定量使用的兩種酚類(lèi)化合物的分析1H 核磁共振。

韌皮部薄壁細(xì)胞

雖然成熟挪威云杉樹(shù)木經(jīng)常被殺害，由樹(shù)皮甲蟲(chóng)齒小蠹和其相關(guān)聯(lián)的藍(lán)染真菌，長(zhǎng)喙殼 polonica，某些基因型的這針葉樹(shù)是更耐樹(shù)皮甲蟲(chóng)或其真菌比其他關(guān)聯(lián)。專(zhuān)門(mén)的韌皮部細(xì)胞的挪威云杉樹(shù)皮的膨脹和改變他們植物化學(xué)成分的含量，對(duì)攻擊的樹(shù)皮甲蟲(chóng)和其微生物副教授。結(jié)合 LMD1H NMR 被用來(lái)比較正常的韌皮部薄壁細(xì)胞和韌皮部薄壁細(xì)胞感染C.polonica從挪威云杉 （圖 2） 的干樹(shù)皮的植物化學(xué)成分含量.

(A)樹(shù)皮塊從正?？刂坪褪芨腥镜捻g皮部薄壁細(xì)胞從同一棵樹(shù)上被收集和存儲(chǔ)在使用前 –80 o C。樣品被嵌入在組織凍存培養(yǎng)基，管理單元冷凍在液氮和 cryosectioned 成 40 μ m 厚片。

(B)激光顯微切割技術(shù)是徠卡 LMD6000 系統(tǒng)上執(zhí)行。在C.polonica-感染樣品，感染細(xì)胞本身不被收集，但細(xì)胞的感染網(wǎng)站旁邊被選為分析。兩個(gè)健康層的韌皮部薄壁細(xì)胞間的細(xì)胞層作為源用于篩胞。耗時(shí)集合所需的每個(gè)樣本的 3 — — 5 h。每個(gè)管的植物材料的收集時(shí)間只限于 1 — — 2 h，以避免樣品材料升溫。

(C)無(wú)形的肉眼，樣品被不干燥和直接用氘代甲醇提取和轉(zhuǎn)移到核磁共振管。

(D) 1H-NMR 譜提取的立即記錄并與酚醛引用比較。二苯乙烯苷 astringin 被證明是位于韌皮部薄壁細(xì)胞的主要次生代謝產(chǎn)物，在相鄰篩細(xì)胞顯著較低的濃度。黃酮 (+)-兒茶素在韌皮部薄壁細(xì)胞后出現(xiàn)感染的C.polonica，雖然減少了 astringin 的水平，相比，在非感染細(xì)胞。

LMD 作為一種工具，調(diào)查中黑暗和半透明腺金絲桃屬植物物種的代謝配置文件

貫葉連翹，通常稱(chēng)為圣約翰草是全球暢銷(xiāo)的藥用植物之一。輕度到中度的抑郁可以有效治療，與對(duì)照臨床試驗(yàn)證明這種植物地上部分的籌備工作。黃酮類(lèi)化合物、 呫噸酮、 生物類(lèi)黃酮、 等其它尤其是異戊烯基 phloroglucinols 貫葉金絲桃素和 adhyperforin 等都是由屬金絲桃屬植物的 Hypericaceae 的成員產(chǎn)生的主要植物次生代謝產(chǎn)物植物家庭。這些化合物都被本地化的多細(xì)胞，球狀或隧道狀聚合等分泌道和黑暗和半透明的腺體。我們選擇了現(xiàn)代技術(shù)的結(jié)合： LMD 和矩陣無(wú)紫外激光解吸電離 — — 大規(guī)模光譜成像 （LDI MSI） 和經(jīng)典的方法： 提取的整株植物材料使用的有機(jī)溶劑，來(lái)隔離并識(shí)別高度本地化的 UV 吸收化合物.

(A)以消費(fèi)稅的黑暗和半透明的腺體，萼片和花瓣的H.貫葉連翹和H.reflexum，從這些固定之間薄玻璃片和一個(gè)特制的金屬框架 — — 習(xí)慣關(guān)長(zhǎng) SC Dilatris屬，如上文所述的過(guò)程類(lèi)似。

(B)從花瓣深色的腺體和從黑暗和半透明腺體的夾層葉進(jìn)行氮固態(tài)激光器的徠卡 LMD6000 系統(tǒng)。

(C)收集的腺體簡(jiǎn)要離心和甲醇被加入到微圓管內(nèi)。

(D)后短暫的超聲波，整除數(shù)的個(gè)別樣品溶液被轉(zhuǎn)移到 MALDI 板和干果上他們 LDI-質(zhì)譜調(diào)查。沒(méi)有矩陣的電離是必要的可能是因?yàn)檩^強(qiáng)的紫外吸收植物次生代謝物的。激光微解剖深色的腺體的花瓣，黑色結(jié)節(jié)和樹(shù)葉的半透明腺體的 LDI-質(zhì)譜分析揭示了存在的不同植物化學(xué)成分的簡(jiǎn)介等其它、 黃酮類(lèi)化合物及 phloroglucinols 在不同本地化的腺體。

LMD 作為一種工具來(lái)研究防御次生代謝產(chǎn)物在盾狀腺毛的Colquhounia 黑老虎變種翅果油樹(shù)

東南亞國(guó)家屬Colquhounia從唇形植物家庭是一個(gè) colquhounoids A — — C，一類(lèi)新的 C 的一個(gè)特殊群體的來(lái)源25萜類(lèi)化合物，含有。葉、 芽和這種植物的莖是由一層致密的眾多無(wú)腺毛狀體和盾形和頭狀腺毛狀體覆蓋。LMD 和 ultraperformance 液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜 （UPLC/MS） 的組合被用于分析的盾狀腺毛狀體 （圖 3） 的植物配置文件.

(A)的C.黑老虎變種翅果油樹(shù)剛收割的葉子被固定到一個(gè)特制的金屬框架上。

(B)裝入幻燈片上徠卡 LMD7000 系統(tǒng)具腺毛狀體后觀察神經(jīng)纖維，在一個(gè)微圓管內(nèi)收集了 500 人。

(C) 3,000 g，4 o C 3 分） 的短暫離心沉到了水底管的腺毛。提取方法，增加了丙酮和小瓶造影在 4 o C 的 10 分鐘。

(D)與 UPLC/MS 分析然后了上清液。三個(gè)主要的化合物： colquhounoids A — — C，也有從整個(gè)葉片材料從C.黑老虎變種翅果油樹(shù)和毫不含糊地確定的核磁共振和 x 射線(xiàn)衍射的甲醇提取物中分離，被發(fā)現(xiàn)在總離子色譜保留與時(shí)代 25.4、 28.9 和 23.7 min 和積極 ESI 質(zhì)譜與分子量的 430 中、 432、 448，分別 （圖 4）。

LMD 作為一種工具，揭示不同油菜 （甘藍(lán)型油菜L.） 組織中次生代謝產(chǎn)物的分布模式

油菜（甘藍(lán)型油菜）是種植用于生產(chǎn)生物柴油、 動(dòng)物飼料和植物油用于人類(lèi)消費(fèi)。由這個(gè)主要產(chǎn)油作物提供的全球石油生產(chǎn)的重要組成部分 （15%）。脂類(lèi)的主要存儲(chǔ)站點(diǎn)是種子的胚。主要次生代謝物的甘藍(lán)型油菜種子是硫代葡萄糖甙和酚膽堿酯類(lèi)。雖然這些次生代謝產(chǎn)物有腥味屬性，但他們是非常重要的生態(tài)價(jià)值的生物和非生物的相互作用的油菜[。LMD 應(yīng)用四個(gè)組織的各部分 （下胚軸和胚根、 子葉內(nèi)在、 外在子葉和種皮和胚乳） 的甘藍(lán)型油菜種子從彼此使用 LMD

(A)成熟種子的甘藍(lán)型油菜垂直嵌入在組織凍存培養(yǎng)基，立即凍結(jié)在液態(tài)氮和 cryosectioned 成 60 μ m 厚片在使用冷凍切片的 –24 o C。

(B)節(jié)直接登上了對(duì)膜幀幻燈片和解剖使用徠卡 LMD6000 激光顯微切割系統(tǒng)。四個(gè)不同的組織部分先后解剖使用最強(qiáng)的激光強(qiáng)度和移動(dòng)速度最慢的激光。材料的四個(gè)解剖組個(gè)別微細(xì)圓管內(nèi)收集了包括支持膜，被切割和收獲與植物材料的重力。

(C)觀察神經(jīng)纖維材料被然后轉(zhuǎn)移到高效液相色譜法小瓶和 1 毫升 80%（v/v) 甲醇被加入另外提取次生代謝產(chǎn)物在超聲波浴為 10 分鐘，白芥子苷 （10 μ M） 和肉桂酸膽堿酯類(lèi) （10 μ M） 被添加到內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)、 硫代葡萄糖苷，白芥子苷和肉桂酸膽堿酯類(lèi)為芥子堿萃取液。硫代葡萄糖苷分離后從使用陰離子交換固相墨盒的其他化合物。

(D)非硫甙化合物的分析由 LC-女士 LC-爸爸/MS 用來(lái)分析芥子油苷在他們脫硫的形式通過(guò)與那些引用 MS 數(shù)據(jù)和保留時(shí)間的比較。結(jié)果表明硫代葡萄糖苷油菜成熟胚組織中均勻分布。均勻分布的芥子堿作為主導(dǎo)酚醛復(fù)合在油菜胚胎組織支持其倉(cāng)庫(kù)功能。另外非硫代葡萄糖苷組分化合物如循環(huán)亞精胺復(fù)合物僅見(jiàn)于下胚軸和胚根和兩個(gè)黃酮類(lèi)化合物主要是在子葉中找到。

LMD 作為一種工具，消費(fèi)稅的************素分析的毛狀體

******是一種年度雌雄異株植物。它起源于東歐和中亞地區(qū)長(zhǎng)期以來(lái)一直作為一個(gè)來(lái)源為傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)栽培。負(fù)責(zé)C.苜蓿的生物活性化合物似乎是 phytocannabinoids，一個(gè)獨(dú)特的 terpenophenolics 擁有 alkylresorcinol 和單萜烯基群體。******素和精油生產(chǎn)的主要景點(diǎn)是毛狀體，特別是頭狀柄的腺毛。次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)大多是在最后五周的八個(gè)星期的總的開(kāi)花周期期間。因此從周 7:56 上午在開(kāi)花期的腺毛，由 LMD 收獲和******素配置文件由 LCMS 和低溫核磁共振法進(jìn)行分析。

(A)的苞片和花被切成小片 （長(zhǎng)度 0.2 — 0.5 厘米） 和固定在 4%磷酸緩沖甲醛，暴露 10 分鐘真空，一夜之間滲透在-4 ° C，然后安裝與鋼框架 （PET 膜，25 毫米 × 76 毫米） 幻燈片上的碎片.

(B)完好使用徠卡 LMD6000 顯微鏡解剖柄的頭狀的毛，元首和莖，以及作為完整的頭狀無(wú)梗毛。從每個(gè)樣本，25 — — 143 毛狀體被切除并收集的重力在離心管中。觀察神經(jīng)纖維材料當(dāng)時(shí) vortexed 為 1 分鐘，離心離心 5 min。為了避免脫羧基作用和退化的******素，解剖的樣本被存放在-20 ° C LMD 之后直接.

(C)為液相色譜-質(zhì)譜分析，60 μ L 甲醇被添加到每個(gè)觀察神經(jīng)纖維樣品從 4、 5、 6、 7、 和 8 個(gè)星期、 造影 10 分鐘和一夜之間在室溫下孵育。樣品，然后被稀釋在 H2O/甲醇 （2/1，v/v） + 0.1%甲酸溶液。對(duì)于低溫核磁共振測(cè)量，最低限度的氘代氯仿被添加到在 8 周收獲的解剖頭狀柄和頭狀無(wú)梗毛狀體。后發(fā)音為 1 分鐘，溶液轉(zhuǎn)移到核磁共振管的分析。

(D)液相色譜-質(zhì)譜和核磁共振數(shù)據(jù)確定 Δ9-tetrahydrocannabinolic 酸 （THCA） 和醇酸趙虹作為頭狀柄和頭狀無(wú)梗毛狀體的主要的化合物。液相色譜-質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)被用于的******素配置文件觀察神經(jīng)纖維毛狀體收集過(guò)去 5 周的生長(zhǎng)周期的比較研究。結(jié)果表明： 質(zhì)的相似性的調(diào)查樣本。THCA，業(yè)內(nèi)，cannabigerolic 酸 (CBGA) Δ9-四氫******酚，cannabidiol 和 cannbigerol 被確定在所有樣品中開(kāi)花階段。Cannabichromene 和******酚檢測(cè)作為次要化合物僅在完整柄的頭狀毛狀體的樣品和他們的頭在 8 周收獲。

目前我們的基于 LMD 的出版物概要顯示廣闊的多樣性的植物材料，可以準(zhǔn)備獲得本地化的植物化學(xué)信息在細(xì)胞水平 （葉、 莖、 花和種子材料的不同物種從不同植物的家庭）。基于 LMD 的化學(xué)分析可以揭示不均勻和植物發(fā)育階段依賴(lài)特殊組織中次生代謝產(chǎn)物的積累。因此程序可用于確定不同的、 依賴(lài)于器官的生物功能的次生代謝產(chǎn)物。此外有關(guān)代謝產(chǎn)物的特定的本地化信息可能有用來(lái)研究生物合成途徑、 代謝產(chǎn)物的改性和其濃度的調(diào)節(jié)。不同植物材料制備方法為 LMD 的如樣品材料專(zhuān)門(mén)制造的幻燈片系統(tǒng)中直接使用或嵌入的樣品材料之前給出了材料的透射。然而，我們是樣品的意識(shí)到挑戰(zhàn)制訂修改的或新的分析戰(zhàn)略，為每個(gè)新的制備。進(jìn)一步改進(jìn)領(lǐng)域的分析方法可以最小化成功識(shí)別所需的資料。因此可以允許這些難隔離材料樣品的研究減少工作負(fù)荷來(lái)分析這類(lèi)組織和化合物。

我們感謝亞歷山德拉 zum Felde 編輯的幫助。作者非常感謝 Daniel Veit LMD 為構(gòu)建特殊的幻燈片。