在考試和數(shù)字錄音的乘法標(biāo)記熒光標(biāo)本、 兩個(gè)或更多的排放過程中信號(hào)往往可以重疊的*終形象因他們接近的接近度內(nèi)的微觀結(jié)構(gòu)。這種效應(yīng)被稱為定位，通常發(fā)生時(shí)標(biāo)記的熒光分子將綁定到躺在非常接近或相同的空間位置的物鏡。高度特異性的現(xiàn)代合成熒光和古典免疫熒光技術(shù)，加上精密光學(xué)切片和數(shù)字圖像處理馬力共聚焦和多光子顯微鏡，所提供的應(yīng)用極大地改善生物標(biāo)本中檢測(cè)定位的能力。

共定位，在生物的表現(xiàn)形式，是由居住在標(biāo)本中的同一物理位置的兩個(gè)或更多不同分子的存在而定義的。范圍內(nèi)的組織切片、 單個(gè)單元格或在顯微鏡下查看的亞細(xì)胞細(xì)胞器，定位可能表明分子都連接到的相同的受體，但是，在數(shù)字成像技術(shù)，是指發(fā)出的熒光分子共享相同的像素在圖像中的顏色。在共聚焦顯微鏡標(biāo)本被記錄作為數(shù)字圖像組成的一個(gè)多維數(shù)組，包含很多體積元素稱為體素表示三維像素為單位）。體素 （或檢測(cè)卷） 的大小是由物鏡、 照明波長(zhǎng)和共聚焦檢測(cè)儀針孔直徑的數(shù)值孔徑確定的。因此，定位在一個(gè)標(biāo)本，例如 Alexa 氟 488 有兩個(gè)熒光探針的綠色發(fā)射和 Cy3 與橘紅色的排放，是在圖像中以像素表示的含 （經(jīng)常產(chǎn)生各種色調(diào)的橙色和黃色） 這兩個(gè)紅色和綠色的顏色捐款。

作為一個(gè)例子，給出了在圖 1 中的圖像序列說明了在橫向光學(xué)平面 (x-y軸在激光掃描共聚焦顯微鏡)紐蛋白，與粘著和黏著路口相關(guān)蛋白與細(xì)胞骨架蛋白肌動(dòng)蛋白的定位。這些配合服務(wù)作為肌動(dòng)蛋白微絲的形核部位和外部介質(zhì)、 質(zhì)膜和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的交聯(lián)劑。圖 1 (a) 從 Alexa 氟 488 (絲狀肌動(dòng)蛋白) 興奮與 488 納米氬離子激光器是從探測(cè)器通道發(fā)射譜的 Alexa 氟 568 （紐蛋白） 進(jìn)行篩選，當(dāng)興奮 543 納米氦-氖激光，而圖 1 (b) 是經(jīng)過篩選后收集熒光發(fā)射的渠道收集的掃描。數(shù)字相結(jié)合的兩幅圖像 （圖 1(c)) 顯示的兩個(gè)熒光信號(hào)在絲狀肌動(dòng)蛋白纖維的總站共定位。

它是重要的是注意到那定位不是指的可能性，與類似的發(fā)射譜的熒光團(tuán)將出現(xiàn)在相同的像素設(shè)置在復(fù)合圖像中。準(zhǔn)確定位分析是*可能如果熒光發(fā)射光譜要很好地與分離之間熒光團(tuán)，正確的篩選器集 （或光譜狹縫寬度），使用期間的習(xí)得順序。如果譜的流血，通過工件存在因?yàn)橐粋€(gè)高度光譜之間的重疊熒光發(fā)射譜，或由于使用了不正確的篩選器組合，共定位測(cè)量將變得毫無意義。為了避免工件，熒光分子必須仔細(xì)相匹配照明源 （共聚焦顯微鏡在激光線） 的功率譜，同時(shí)仍保持有用程度的發(fā)射波長(zhǎng)之間的分離獲得的*大激勵(lì)效率。在大多數(shù)情況下，熒光共定位分析的明智選擇中獲得滿意的結(jié)果至關(guān)重要。

在圖 2 中，提出了一種比較光譜重疊為一系列的 Alexa 氟染料組合在定位實(shí)驗(yàn)中可能會(huì)有用。所有的發(fā)射譜的比較，正常化，重疊區(qū)域由灰色底紋的指示。在圖 2 (a)，為綠色熒光 Alexa 氟 488 和橘黃色熒光 Alexa 氟 555 染料發(fā)射譜表明峰值波長(zhǎng)，通過人的眼睛也很容易區(qū)分的清晰分離。然而，光譜互相重疊 （灰色陰影區(qū)域） 的適度水平說明了，有相當(dāng)多的排放量從 Alexa 氟 488 發(fā)射波長(zhǎng)峰值在 Alexa 氟 555 （由一條黑線從發(fā)射峰跑到橫坐標(biāo)表示）。這種高水平的信號(hào)流血，通過呈現(xiàn)分離的探頭在 Alexa 氟 488 的熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯大于 Alexa 氟 555，會(huì)發(fā)生大量的因素，包括熒光物鏡人口較大差異的情況下很難。結(jié)果，這些探頭的組合應(yīng)該避免定位在實(shí)驗(yàn)中，或使用只有當(dāng)圖像在同時(shí)加工方面的共聚焦模式下，以減少或消除流血，通過獲得。

Alexa 氟探針之間的光譜重疊隨發(fā)射極大值之間的帶寬增加，如圖 2 (b) 所示。在這種情況下，Alexa 氟 488 和深紅色熒光 Alexa 氟 633 表現(xiàn)顯著降低的程度的重疊時(shí)相比，圖 2 (a)。這兩種染料很容易區(qū)分對(duì)人的眼睛和光譜重疊的程度低應(yīng)該效果不好與*小流血，通過定位在實(shí)驗(yàn)中，條件是每個(gè)探頭的濃度是類似 （請(qǐng)注意，Alexa 氟 633 的深紅色熒光可能很難想象通過顯微鏡目鏡在低濃度時(shí)）。Alexa 氟 633 由 633 納米線的紅色氦-氖激光，*有效地激發(fā)，但也可以用黃色的氦-氖激光的 594 納米線。也許*好的光譜分離中可見發(fā)光 Alexa 氟染料是 Alexa 氟 488 和 Alexa 氟 647 (不說明) 的結(jié)合。這些染料之間幾乎沒有光譜重疊和流血，通過工件應(yīng)該是缺席，甚至含有過多的標(biāo)本中各級(jí) Alexa 氟 488。熒光探針具有這些特點(diǎn)是配備了適當(dāng)?shù)?a title='激光共聚焦顯微鏡' target='_blank' class='seolabel'>激光共聚焦顯微鏡的共定位調(diào)查的理想人選。

決定定位在共聚焦顯微鏡觀察的能力被有限的光學(xué)系統(tǒng)的分辨率和用于照亮試樣的光的波長(zhǎng)。視場(chǎng)熒光和共聚焦顯微鏡具有理論分辨率大約 200 毫微米 （0.2 微米），但在實(shí)踐中，這個(gè)數(shù)字下降到 400 和 600 納米的各種原因，包括顯微鏡、 折光指數(shù)波動(dòng)、 光學(xué)畸變和不當(dāng)?shù)脑嚇又苽涞牟煌亩戎g的一個(gè)值。在幾乎所有情況下，然而，**調(diào)諧的共聚焦顯微鏡的光學(xué)分辨率限制并不足以確定兩個(gè)熒光分子是否附加到一個(gè)單一的物鏡或是否他們甚至駐留在相同的細(xì)胞器。高度特異合成探針或抗體靶向本地化和定義良好的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，很容易受歧視的周圍設(shè)計(jì)了很多實(shí)驗(yàn)協(xié)議。其他人產(chǎn)生標(biāo)本與顯示探針之間的重疊程度高的地區(qū)。

對(duì)于是小于 5 微米的厚度，如貼壁細(xì)胞或非常薄的組織切片的標(biāo)本定量定位分析往往是可能的在常規(guī)視場(chǎng)熒光顯微鏡。然而，對(duì)于較厚的標(biāo)本，圖像應(yīng)記錄作為光學(xué)切片的有限的軸向尺寸，以確定是否看似讓出熒光團(tuán)實(shí)際上駐留在同一側(cè)的焦平面或他們是否垂直疊加*過對(duì)方沿顯微鏡z-軸。熒光團(tuán)厚厚的標(biāo)本中的共定位分析應(yīng)由獲得使用激光掃描或旋轉(zhuǎn)磁盤共聚焦或多光子顯微鏡光學(xué)切片。多光子儀器往往能夠激發(fā)這兩個(gè)熒光雙標(biāo)記標(biāo)本中與單一的近紅外激光譜線在焦點(diǎn)的物鏡高度定義卷中。這個(gè)**的功能限制到居住只在焦平面，這將大大減少光漂白工件和背景噪音的熒光的熒光發(fā)射。

共定位分析軟件

熒光共定位在一個(gè)標(biāo)本的程度被衡量通過比較中獲得的圖像的每個(gè)的等效像素位置的顏色值。在分析過程中的*步涉及到將賴以進(jìn)行定位測(cè)量，無論是從兩個(gè)獨(dú)立的通道單波長(zhǎng)并購(gòu) （*技術(shù)） 或乘法標(biāo)記的樣品作為一個(gè)單一的形象獲得派生復(fù)合材料作為圖像顯示。檢查時(shí)有兩個(gè)以上的標(biāo)簽的標(biāo)本，在一個(gè)單一的計(jì)算，期間處理的只有兩個(gè) pseudocolors，但所有的偽彩色排列可以隨后被選為對(duì)的共定位分析。通常情況下，由于傳統(tǒng)使用的氬離子、 氬、 氪和氦-氖激光，有譜線能夠有效地令人興奮的強(qiáng)烈吸收在藍(lán)色和綠色區(qū)域的熒光共聚焦熒光選擇紅綠雙。此外，人類的眼睛是綠色和紅色的顏色組中的色調(diào)更敏感。

共定位分析的 pseudocolored 的標(biāo)本圖像圖形顯示方便代表由散點(diǎn)圖（有時(shí)稱為fluorogram），與相關(guān)的關(guān)系或兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間的關(guān)聯(lián)。一個(gè)散點(diǎn)圖圖的一個(gè)偽彩色 （或通道） 與另一個(gè)用于每個(gè)像素在圖像中，強(qiáng)度或所選的區(qū)域的利益，在二維直方圖上 （見圖 3 和圖 4）。一個(gè)通道 （通常是綠色的） 用圖表表示沿x-軸，而其他 （通常為紅色) 在y上繪制-強(qiáng)度從 0 到 255 的橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)軸。因此，由一對(duì)強(qiáng)度作為坐標(biāo)可分辨的特點(diǎn)復(fù)合圖像每個(gè)像素是在笛卡爾坐標(biāo)系統(tǒng)中。由的強(qiáng)度對(duì)生成的分布格局的分析可查明的熒光共定位，以及背景歧視、 流血，通過、 漂白和缺乏登記之間的各個(gè)通道。

圖 3 顯示了三個(gè)雙通道共聚焦顯微鏡光學(xué)切片圖像平面 （pseudocolored 紅色和綠色） 從標(biāo)本有不同程度的熒光共定位，以及其相應(yīng)的散。有非常低強(qiáng)度每個(gè)通道中的像素位于原點(diǎn) (0，0) 附近的散點(diǎn)圖，亮的像素被分散遠(yuǎn)和跨整個(gè)關(guān)系圖。在紅色和綠色通道關(guān)聯(lián)一個(gè)散點(diǎn)圖，純紅色和綠色像素為單位） 傾向于集中附近的軸的情節(jié)，而讓出像素為單位），如果存在，出現(xiàn)彩色與橙色和黃******調(diào) (取決于定位的程度），與落在中心附近 (x = y） 和右上角的散點(diǎn)圖。

圖 3 給出了的標(biāo)本包括大鼠大腦海馬冠狀厚斷面標(biāo)記有 Alexa 氟 488 （神經(jīng)絲） 和 Alexa 氟 568 （膠質(zhì)纖維酸性蛋白 ；膠質(zhì)纖維酸性蛋白，圖 3(a))。印度麂鹿皮膚成纖維細(xì)胞染色 Alexa 氟 568 靶向紐蛋白和 Alexa 氟 488 共軛對(duì)鬼筆 （絲狀肌動(dòng)蛋白) 中說明了圖 3 (b)，而兔腎上皮細(xì)胞 （RK 13行） 共同表達(dá)熒光蛋白，DsRed 和 EYFP，定位于細(xì)胞核，描繪在圖 3 (c)。關(guān)聯(lián)的散位于下方的標(biāo)本圖像 （例如，圖 3 (d) 是為圖 3(a)) 的散點(diǎn)圖和定位兩個(gè)通道的程度由白色字母和數(shù)字在左下角的每個(gè)散點(diǎn)圖。在圖 3 (a)，并逐步更高程度的定位功能系數(shù)的大約 30 ％ 和 85 ％，分別在圖 3 (b) 3 (c)，注意到相對(duì)缺乏的定位 （只有兩個(gè)通道的一對(duì)夫婦 %）。

散點(diǎn)圖分析熒光共定位使用的典型軟件提供的共聚焦顯微鏡及成像程序制造商的售后所顯示的圖像在圖 4 中，這使用印度麂堿性成纖維細(xì)胞細(xì)胞染色與 Alexa 氟 568 （紐蛋白 ； 紅色通道） 和 Alexa 氟 488 （絲狀肌動(dòng)蛋白 ； 綠色通道） 生成的序列概述。感興趣區(qū)域的選擇是為分析在散點(diǎn)圖，如圖 4 (a) 中的白色矩形由表示。這一地區(qū)設(shè)置門檻水平的信號(hào)，將包括在大多數(shù)定位軟件程序所進(jìn)行的分析。

概述了感興趣的領(lǐng)域的水平和垂直邊緣應(yīng)保持一致，要排除背景信號(hào)，聚集沿x軸和y-軸的散點(diǎn)圖。僅從包含在所選區(qū)域的邊界內(nèi)的像素所產(chǎn)生的信號(hào)分析的定位估計(jì)。試樣中的像素區(qū)域重疊容易轉(zhuǎn)換成一個(gè)定位二值化閾值掩碼 （圖 4(b))，可以疊加在圖像 （圖有賴于作為定位地圖。地圖圖 4 (c) 所示的閾值部分顯示讓出的領(lǐng)域在白色的但這種顏色可以隨時(shí)改變與大多數(shù)軟件應(yīng)用程序到生產(chǎn)更高程度的對(duì)比與原始的 pseudocolors 的另一種顏色。

如上所述，使用從散獲得和所選的信息可以獲得定量評(píng)估的熒光定位在共聚焦光學(xué)切片的感興趣區(qū)域。幾個(gè)值生成使用的整個(gè)散點(diǎn)圖的信息，而其他人都來自像素值包含在所選區(qū)域感興趣。用于分析的變量之間的整個(gè)的散點(diǎn)圖是重疊的皮爾遜相關(guān)系數(shù) （比），是重疊的為了描述的兩種模式之間度匹配到另一個(gè)圖像模式識(shí)別中的應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一。皮爾遜相關(guān)系數(shù)是根據(jù)公式計(jì)算的：

(1)

S1在哪里像素為單位） 中的*渠道和S2的信號(hào)強(qiáng)度是信號(hào)強(qiáng)度的第二個(gè)通道中的像素。S1(average)和S2(average)的值分別是*和第二次的通道中的像素的平均值。在皮爾遜的相關(guān)性，從原始的強(qiáng)度值中減去平均像素強(qiáng)度值。其結(jié)果是，此系數(shù)的值范圍從-1 到 1，值為-1 表示完全缺乏從圖像，像素和的值為 1 指示**圖像配準(zhǔn)之間的重疊。皮爾遜相關(guān)系數(shù)僅占形狀兩個(gè)圖像之間的相似度，并不取決于圖像的像素強(qiáng)度值。當(dāng)將此系數(shù)應(yīng)用于共定位分析，然而，潛在的負(fù)面值是難以解釋，需要另一種辦法來澄清分析結(jié)果。

更簡(jiǎn)單的技術(shù)往往被用來替代的相關(guān)系數(shù)計(jì)算涉及到消除減法的平均像素強(qiáng)度值從原來的強(qiáng)度。定義正式的重疊系數(shù) （R），此值范圍介于 0 和 1 之間，則對(duì)圖像分析中的強(qiáng)度變化不敏感。重疊系數(shù)的定義為：

(2)

通道強(qiáng)度在分子中的產(chǎn)品返回一個(gè)值，顯著，只有當(dāng)兩個(gè)值都屬于一個(gè)像素所涉及的共定位 （如果這兩個(gè)強(qiáng)度大于零）。因此，方程（2）的分子是成正比的 colocalizing 的像素?cái)?shù)。以類似的方式，重疊方程的分母是成正比的像素?cái)?shù)從這兩個(gè)組件在圖像中，不管是否存在定位 （注：組件的定義的紅色和綠色的圖像或像素陣列從通道 1 和通道 2，分別）。重疊系數(shù)的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是其對(duì)各種組件的形象，往往產(chǎn)生的熒光染料濃度波動(dòng)、 漂白、 量子效率變化和非等效電子通道設(shè)置，信號(hào)強(qiáng)度差異的相對(duì)不敏感。

使用重疊系數(shù)的*重要的缺點(diǎn)是比率的每個(gè)通道中的圖像特征的人數(shù)之間的**影響力。為了減輕這種依賴關(guān)系，重疊系數(shù)被劃分成兩個(gè)不同分項(xiàng)系數(shù)，稱為k(1)和k(2)表達(dá)的共定位程度作為兩個(gè)獨(dú)立的參數(shù)：

(3)

重疊系數(shù)、 k(1)和k(2)，描述強(qiáng)度之間的渠道，與k(1)正在敏感中的通道 2 強(qiáng)度的差異 （綠色信號(hào)），而k(2)線性依賴于從通道 1 （紅色信號(hào)） 像素的強(qiáng)度的差異。到目前為止所描述的方程是重疊的能夠產(chǎn)生程度有關(guān)的信息和可以帳戶的強(qiáng)度變化之間的顏色通道。為了估計(jì)在讓出領(lǐng)域整體量讓出熒光圖像的一個(gè)顏色通道的貢獻(xiàn)，一組額外的共定位系數(shù)、 m(1)和m(2)的定義：

(4)

共定位系數(shù)m(1)被采用描述讓出的地區(qū)，從通道 1 貢獻(xiàn)系數(shù)m(2)是用來描述從通道 2 同樣的貢獻(xiàn)。請(qǐng)注意變量S1(i,coloc)等于S1(i)如果S2(i)是更多比零，反之為變量S2(i,coloc)。這些系數(shù)是熒光復(fù)合圖像，相對(duì)于該通道中的總熒光每個(gè)通道中的 colocalizing 熒光團(tuán)的數(shù)量成正比。即使時(shí)在兩個(gè)圖像通道的信號(hào)強(qiáng)度有明顯不同的層次，共定位系數(shù)m(1)和m(2)是可以確定的。

共定位系數(shù)第二雙可以為像素強(qiáng)度范圍劃定在散點(diǎn)圖上的感興趣的區(qū)域由定義的計(jì)算。系數(shù)M(1)被用于描述信道 1 熒光讓出的區(qū)域，所作的貢獻(xiàn)，而M(2)用來描述信道 2 熒光基團(tuán)所作的貢獻(xiàn)。這些定位系數(shù)的定義如下：

(5)

在哪里S1(i,coloc)等于S1(i) ，如果S2(i)在于興趣閾值 （左、 右兩邊的矩形 ROI） 的區(qū)域內(nèi)和等于零，如果S2(i)表示一個(gè)像素以外的閾值水平。同樣， S2(i,coloc)等于S2(i) ，如果S1(i)在于興趣閾值 （頂部和底部?jī)蛇吘匦?ROI） 的區(qū)域內(nèi)和等于零，如果S1(i)感興趣的區(qū)域外。換句話說，對(duì)于每個(gè)通道，分子表示也有一個(gè)組件從另一個(gè)通道，該通道中的所有像素強(qiáng)度的總和而，分母表示所有強(qiáng)度的總和從通道。這些系數(shù)是 colocalizing 中的對(duì)象的每個(gè)通道的復(fù)合圖像，相對(duì)于該通道中的總熒光熒光的量成正比的。

商業(yè)上可用的定位軟件分析程序的大部分是能夠計(jì)算出的參數(shù)，上文所述，包括皮爾遜相關(guān)系數(shù)、 總重迭系數(shù)，以及個(gè)別k(x)、字母和字母定位系數(shù)。另外，許多程序都包含應(yīng)用背景減法校正，生成的整個(gè)形象，散和/或執(zhí)行單一的雙通道復(fù)合圖像或沿軸向平面光學(xué)堆棧上使用選定的感興趣區(qū)域的計(jì)算的算法。*重要的數(shù)據(jù)輸出，從這些軟件包是重疊的的共定位系數(shù)、 指示信號(hào)之間的相對(duì)程度。例如，定位系數(shù)值為 0.75 的熒光體在通道 1 表示有一個(gè)通道 2 組件，除以所有通道 1 強(qiáng)度，總和的所有通道 1 強(qiáng)度的比例是 75%。這是定位的相對(duì)較高。同樣的值為 0.25 為通道 2 熒光指示定位 （等于三分之一的通道 1 熒光） 顯著降低的的級(jí)別。

文物和標(biāo)本共定位分析中考慮的因素

共定位分析時(shí)遇到的*重要的文物中是光譜流血，通過發(fā)射譜重疊、 自體熒光 （主要是在組織標(biāo)本），和特異性抗體或合成熒光染色。熒光共振能量轉(zhuǎn)移 （煩惱） 也是一個(gè)潛在工件與讓出熒光團(tuán)有緊密的重疊譜線輪廓。這些工件的任何有能力生產(chǎn)圖像像素出現(xiàn)黃色或橙色，但不是來自共定位，檢查標(biāo)本用綠色和紅色熒光探針標(biāo)記。

也許*常見的問題是流血，通過熒光強(qiáng)度的時(shí)成像具有兩個(gè)或更多的熒光標(biāo)簽的標(biāo)本。例如，當(dāng)雙標(biāo)記與傳統(tǒng)的綠色和紅色探頭，熒光素和羅丹明，流血，通過只可以通過使用優(yōu)化的熒光篩選器設(shè)置，減少，但永遠(yuǎn)不會(huì)完全消除了。這種效應(yīng)是重疊的由于這樣一個(gè)事實(shí)，這些染料有很廣泛的吸收光譜和發(fā)射光譜，表現(xiàn)出很大程度。因此，激發(fā)熒光使用氬離子激光器 488 納米光譜線也將產(chǎn)生勵(lì)磁羅丹明，雖然程度較輕。此外，熒光發(fā)射將設(shè)置預(yù)留羅丹明，生產(chǎn)出現(xiàn)黃色或橙色甚至在定位缺席的情況下的像素的光電倍增管通道或視場(chǎng)篩選器中檢測(cè)到。為了進(jìn)行這些的定位實(shí)驗(yàn)和類似熒光團(tuán)，流血，通過工件必須完全消除。

與流血，通過在傳統(tǒng)熒光團(tuán) （如熒光素和羅丹明） 相關(guān)的問題通?？梢酝ㄟ^使用更新的生物學(xué)上的改進(jìn)和光明合成探測(cè)器，如 Alexa 氟家庭或碳菁 (Cy 系列) 染料克服。許多這些專門設(shè)計(jì)的有機(jī)分子的陳列很窄的發(fā)射譜 （相比于傳統(tǒng)的探頭），恰逢弧光放電燈的大消光系數(shù)和激光光譜線、 改進(jìn)的量子產(chǎn)率、 減少的漂白和熒光排放對(duì)環(huán)境變量的更少依賴。此外，這些*的探頭均可提供激勵(lì)譜線，橫跨大約 400 納米，從紫外到近紅外，確保各種各樣的選擇，以配合照明光源與*小排放光譜重疊帶寬。

熒光，顯著得多用甲醛固定組織標(biāo)本，產(chǎn)生類似的外觀，以流血，通過工件。勵(lì)磁常常展出自體熒光試樣的結(jié)果在檢測(cè)中排放的其他渠道，產(chǎn)量似乎已經(jīng)讓出熒光團(tuán)的圖像。過度背景染色的抗體和合成熒光團(tuán)也可以像在那里兩個(gè)熒光團(tuán)都表現(xiàn)出高度的非特異性染色的區(qū)域定位。這個(gè)工件可以通常會(huì)避免或者，至少，大大減少通過仔細(xì)制備樣品和監(jiān)測(cè)議定書 》 與適當(dāng)?shù)目刂啤?/span>

共定位調(diào)查所有流血，通過、 自體熒光和非特異性熒光工件已經(jīng)被淘汰，每次只可以考慮準(zhǔn)確。*有效的辦法是聘請(qǐng)序貫勵(lì)磁在共聚焦顯微鏡掃描配置，以收集與窄帶發(fā)射篩選器 （或窄縫寬度為分光儀器） 發(fā)射信號(hào)。同時(shí)，應(yīng)檢查單標(biāo)記控制標(biāo)本，以確保完全消除的流血，通過和未染色的控件可以有效地監(jiān)測(cè)自體熒光。流血，通過校正軟件是可用于很多的共聚焦顯微鏡，使校正而被捕獲的圖像。

為各種標(biāo)本，說明在圖 5 中流血，通過工件及他們?cè)诩す鈷呙韫簿劢癸@微鏡的更正。在圖 5 (a) 提出了一種對(duì)成纖維細(xì)胞描繪流血，通過 Alexa 氟 488 （綠色熒光） 的進(jìn) MitoTracker 紅色 （紅色熒光） 打算當(dāng)標(biāo)本與氬離子 （488 納米光譜線） 和綠色氦-氖 （543 納米線） 激光掃描，同時(shí)產(chǎn)生黃色肌動(dòng)蛋白微絲的通道。序貫掃描和檢測(cè) （圖 5(d)) 流血，通過消除了。同樣地，流血，通過在厚厚的小鼠腸道 （圖 5(b)) 發(fā)生與同時(shí)掃描使用 Cy3 和核探針，DRAQ5，加上綠色和紅色的氦-氖 （633 納米線） 勵(lì)磁。按順序掃描標(biāo)本 （圖 5(e)) 中刪除偽裝成共定位的流血，通過工件。

在哪里使用*過兩個(gè)的激光掃描多標(biāo)記的標(biāo)本的情況下，流血，通過工件通?？捎^察到幾個(gè)頻道，數(shù)字披露和 5 (f) 為的厚厚的 Alexa 氟 488 （神經(jīng)絲）、 Alexa 氟 568 （GFAP） 與 DRAQ5 標(biāo)記的大鼠腦中所示 （核）。流血，通過時(shí)，會(huì)出現(xiàn)第二和第三渠道標(biāo)本被同時(shí)掃描與三個(gè)激光器 （圖 5(c))，指示潛在的共定位之間在這標(biāo)本的中間絲。然而，在啟動(dòng)順序掃描和數(shù)據(jù)收集，時(shí)花絲只出現(xiàn)在他們各自的渠道 （圖 5(f))，消除的熒光定位在這些結(jié)構(gòu)中的注意事項(xiàng)。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移，從理論上講可以測(cè)量短的距離之間兩個(gè)密切定位熒光團(tuán)，也是非常有用的工具，用于監(jiān)測(cè)定位。然而，這種現(xiàn)象可以經(jīng)常導(dǎo)致工件共定位分析期間除非必要的 FRET 的具體參數(shù)是很好理解，仔細(xì)考慮在實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)過程中。具體而言，調(diào)查人員應(yīng)該關(guān)注的時(shí)候使用探針有譜線，占領(lǐng)相同的帶寬，特別是在那里的*次的熒光發(fā)射譜與激勵(lì)譜的第二個(gè)重疊的區(qū)域。這些標(biāo)本的能量轉(zhuǎn)移被表現(xiàn)在從*個(gè)熒光基團(tuán)和類似的意外增加熒光發(fā)射意外下降為第二個(gè)探測(cè)器的排放強(qiáng)度。密切相關(guān)的熒光團(tuán)之間的互動(dòng)也可以導(dǎo)致淬火的發(fā)射的熒光信號(hào)，取決于環(huán)境條件。

經(jīng)過認(rèn)真的樣品制備技術(shù)可以規(guī)避的許多潛在工件定位分析中。如上文所討論，應(yīng)選擇熒光探針，廣泛有*小的重疊分離發(fā)射譜線。如果可能的話，選擇綠色的熒光，有一個(gè)狹窄的排放標(biāo)本 （如 Alexa Fluors 或量子點(diǎn)） 和深紅色或近紅外區(qū)域發(fā)出紅色熒光。小學(xué)和中學(xué)的抗體必須測(cè)試的交叉反應(yīng)性非特定背景染色。應(yīng)優(yōu)化加載合成熒光團(tuán)和標(biāo)記二級(jí)抗體的濃度，以確保類似的亮度水平，尤其是當(dāng)物鏡豐度是完全不同。影響熒光亮度因素是激發(fā)效率、 量子產(chǎn)率、 消光系數(shù)、 濃度、 以及環(huán)境因素，如 ph 值、 離子濃度、 疏水性、 和粘度。對(duì)照標(biāo)本應(yīng)該也準(zhǔn)備與每個(gè)熒光基團(tuán)分別和分別為流血，通過分析和自體熒光表征染色的缺席。仔細(xì)注意小細(xì)節(jié)，在染色的協(xié)議將會(huì)減輕康復(fù)通過收購(gòu)后加工算法的數(shù)字圖像的必要性。

實(shí)踐方面的共定位分析

在審查和分析復(fù)雜的熒光圖案，采用聯(lián)合偽彩色顯示是非常有用，因?yàn)橐言谏衔臄⑹龅摹?/span>通常情況下，兩個(gè)顏色通道被選中，*常見的是綠色和紅色的所以，重疊區(qū)域出現(xiàn)黃色。其他顏色配對(duì)，如藍(lán)色和綠色 （高產(chǎn)青色） 和藍(lán)色和紅色 （產(chǎn)生洋紅色），還可采用，卻是少得多有效的視覺檢查減少人眼對(duì)反射藍(lán)色波長(zhǎng)的敏感性。然而，在許多情況下，特別是與三色圖像，使用藍(lán)色通道偽彩色是不可避免的。

在規(guī)劃中的圖像采集與顯示參數(shù)，應(yīng)采用標(biāo)準(zhǔn)以便合并的圖像表現(xiàn)出相同的動(dòng)態(tài)范圍和每個(gè)熒光信號(hào)偏移量。事實(shí)上，標(biāo)準(zhǔn)共聚焦顯微鏡觀察實(shí)踐表明這種方法為所有日常樣品分析。一旦結(jié)合，重疊的紅色和綠色信號(hào)如果收集了足夠的光子會(huì)產(chǎn)生明確的亮黃色信號(hào)。光子餓在實(shí)驗(yàn)中，所產(chǎn)生的暗黃******調(diào)讓出熒光團(tuán)，與平等貢獻(xiàn)的綠色和紅色的背景將出現(xiàn)棕色。

應(yīng)分別調(diào)整每個(gè)通道的偏移和增益控制 (的背景設(shè)置為零和飽和度到 255），每個(gè)熒光顯示使用完整的 8 位 （256 灰度級(jí)） 范圍。然后能夠處理和合并單獨(dú)的圖像。雖然這是一種方便的方法來獲取和顯示彩色圖像，試樣中的兩個(gè)信號(hào)的相對(duì)振幅不能確定，因?yàn)槊總€(gè)信號(hào)的收購(gòu)來填充圖像的整個(gè)位深度。因此，給定的顏色通道內(nèi)的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的分析將需要的渠道，進(jìn)行配置以類似的方式在光電倍增管電壓、 增益和偏移量的問候。

如果不平衡的采集和處理的技術(shù)，關(guān)于合并后的彩色圖像中定位不準(zhǔn)確解釋可以導(dǎo)致從不當(dāng)增益和偏移量的配置的光電倍增管期間采集或由于極端直方圖拉伸圖像處理過程中。例如，如果黑級(jí) （偏移） 值太高，不同的顏色分割可以發(fā)生低的黑色級(jí)別設(shè)置和降低的對(duì)比度條件下觀察，在相同的結(jié)構(gòu)。為關(guān)鍵的應(yīng)用程序，可以應(yīng)用比率成像技術(shù)來區(qū)分，是讓出的信號(hào)和信號(hào)，只是部分地重疊。

**對(duì)齊的熒光成像系統(tǒng)將作為精確地注冊(cè)，像素的像素，在使用不同的篩選器集時(shí)，探測(cè)器圖像試樣中的點(diǎn)源。然而，工件如不足顏色校正的物鏡或差對(duì)齊的過濾器可以導(dǎo)致丟失注冊(cè)期間顏色合并，熒光信號(hào)之間的經(jīng)常辨認(rèn)顏色的均勻位移。對(duì)于具有復(fù)雜的圖案和混合物的明亮和昏暗的信號(hào)的圖像，這種效應(yīng)可以去未被發(fā)現(xiàn)，從而導(dǎo)致信號(hào)結(jié)構(gòu)的分布是不同或部分重疊的結(jié)論。

位移偽影可以減輕 （操作被稱為平移） 的圖像處理過程中的合并后的圖像恢復(fù)注冊(cè)使用許多可用的軟件包。對(duì)齊一組顏色層通過平移的能力需要在標(biāo)本中的每一層都存在重合參考點(diǎn)的存在。如果乘沾上的參考點(diǎn)不存在，多色熒光乳膠微球可以添加到在高稀釋收益每人學(xué)視域與蓋板玻璃安裝前的幾個(gè)珠子的標(biāo)本。為關(guān)鍵的應(yīng)用程序，單個(gè)篩選器集與多帶通二向色鏡和障礙篩選器可用于不同的激光或特定于熒光染料的激發(fā)過濾器所有的熒光信號(hào)。這種配置在共聚焦顯微鏡中使用，適用于視場(chǎng)熒光色彩校準(zhǔn)在哪里是關(guān)鍵。

在圖 6 中所示是幾個(gè)上文討論過的常見工件常常妨礙準(zhǔn)確定位分析標(biāo)本用多個(gè)熒光團(tuán) （請(qǐng)注意在圖 6 中的所有熒光組合都發(fā)出只有綠色和紅色熒光） 標(biāo)記中。人類女性骨肉瘤上皮細(xì)胞 （u2線） 轉(zhuǎn)染增強(qiáng)黃色熒光蛋白融合到過氧化物的靶向性的多肽序列 （綠色熒光），和隨后 immunofluorescently 用共軛對(duì) Alexa 氟 568 （紅色熒光） 針對(duì)過氧化物酶體膜蛋白 （PMP-70） 的二次抗體標(biāo)記中呈現(xiàn)的數(shù)字 6 (a) 和混亂。圖 6 (a) 中的圖像的黑色水平設(shè)置為太高，從而導(dǎo)致降低強(qiáng)度為黃色熒光蛋白標(biāo)簽。這種錯(cuò)誤扭曲共定位分析產(chǎn)生的重疊像素從綠色通道人工低可探測(cè)的水平。適當(dāng)層次分明的圖像所示圖混亂，演示顯著更高程度的定位。

在恒河猴腎上皮細(xì)胞 （LLC MK2線） 的線粒體網(wǎng)絡(luò)共同轉(zhuǎn)染增強(qiáng)的黃 （EYFP） 與HcRed1熒光蛋白載體靶向線粒體的肽序列。在成像，過程中多亮 EYFP 急劇黯然失色的熒光信號(hào)從 HcRed1，這是弱幾乎 100 倍，當(dāng)探測(cè)器渠道有類似電壓、 增益和偏移量的設(shè)置 （圖 6(b))。調(diào)整中 HcRed1 探測(cè)器來平衡的熒光蛋白熒光光譜強(qiáng)度的通道值克服了這種差異，揭示了大量的定位 （圖 6(e))。請(qǐng)注意在調(diào)整后的圖像相比，支配與緊密匹配通道捕獲的圖像的綠******調(diào)熒光的黃色外觀。

錯(cuò)誤登記的重疊的頻道所示圖劃定為 · 塔赫爾卵巢細(xì)胞 （HJ1。Ov線) 沾滿 Alexa 氟 488 共軛對(duì)鬼筆 （綠色絲狀肌動(dòng)蛋白) 和 Alexa 氟 568 二次抗體靶向抗粘著斑蛋白鼠標(biāo) (焦粘連)。肌動(dòng)蛋白絲兩端應(yīng)腫瘤與紐蛋白在此標(biāo)本，但他們的不稍有注冊(cè)的圖件，是用在圖像的右下角的紅色和綠色熒光標(biāo)記微球。發(fā)布采集圖像處理要對(duì)齊的渠道 （圖 6(f)) 共定位分析還原圖像配準(zhǔn) (和微球的） 產(chǎn)生*的候選人。

結(jié)論

之間在進(jìn)行調(diào)查的熒光基團(tuán)時(shí)要考慮的*重要的點(diǎn)定位是確保標(biāo)本貼標(biāo)的盡可能高的質(zhì)量。應(yīng)該分析和選擇的特異性、 低的背景下和缺乏交叉反應(yīng)性抗體和合成熒光團(tuán)。為了減少流血，通過工件，熒光探針組合與廣泛分離發(fā)射譜是*適合用于定位實(shí)驗(yàn)。適當(dāng)?shù)目刂疲?biāo)本用標(biāo)記每個(gè)探頭單以及污泥而不染的自體熒光標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)編寫和流血，通過在實(shí)際的實(shí)驗(yàn)條件下的審議。一旦試樣參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，可以解決儀器和軟件方面的考慮。它是重要的是記住可憐的試樣的制備通常不能由數(shù)字圖像處理技術(shù)克服。在大多數(shù)情況下，貼標(biāo)條件的完善將節(jié)省大量的時(shí)間和*終產(chǎn)量**的結(jié)果。

談到的儀器配置要求，*高質(zhì)量的復(fù)消色差顯微鏡物鏡是減少色差，會(huì)消極地影響定量定位計(jì)算所需。許多制造商已經(jīng)介紹了計(jì)劃復(fù)消色差的物鏡在整個(gè)可見的光的波長(zhǎng)區(qū)域 （400-700 納米），大大有益于定量熒光顯微鏡調(diào)查矯正色差。熒光發(fā)射的所有篩選器應(yīng)具有與熒光譜線輪廓匹配的帶通傳輸特性進(jìn)行優(yōu)化。這是一個(gè)*重要的考慮因素，控制流血，通過從其他熒光試樣中。如果流血，通過檢測(cè)到控件 （單探頭和自體熒光） 中，順序掃描的標(biāo)本用顯微鏡配備聲光可調(diào)諧濾光器 （AOTF） 為 multitracking 將產(chǎn)生*佳的結(jié)果。在某些情況下，流血，通過軟件校正可能有必要在進(jìn)行定位分析之前。