徠卡顯微鏡熒光蛋白光譜特性的簡介

熒光顯微鏡的前景極大地改變熒光蛋白在20世紀50年代的發(fā)現(xiàn)。 其出發(fā)點是水母水母綠色熒光蛋白（GFP）通過檢測Osamo下村 。 數(shù)百GFP的突變體后，熒光蛋白的范圍達到從藍色到紅色的光譜。 更多的熒光蛋白來自其它物種的像珊瑚蟲未來的出現(xiàn)偏移發(fā)射波長連到遠紅外區(qū)。 的可能性，這個調色板提供了科學家尋找他們的需求的絕佳選擇合適的熒光蛋白標記。 本文提供的最新替代品的概述，并提供了明確安排表中所有相關的光譜特性。

從 A熒光蛋白 維多利亞

綠色熒光蛋白或其變體的光譜特性在于氨基酸結構上形成的發(fā)色團 （圖1）。這可以是在3位的氨基酸65-67或殘基的接近這個位置（例如YFP）。 除了關于發(fā)色團的主要突變，研究還對其他位點定向誘變進行，以提高其它因素，如蛋白質的成熟和表達在異種細胞系統(tǒng)（例如，密碼子使用，蛋白質折疊在生理溫度下）。 需要注意的是A. 維多利亞是一個比較原始的海洋生物，無全身發(fā)熱系統(tǒng)。

即使GFP是因為它的亮度和高光穩(wěn)定性的最流行的FP中的一個，它有兩個主要的缺點。 這些都是一定的敏感性至pH和輕微趨勢二聚化。 二聚化或寡聚化是許多FP的一個問題。 他們的偏好凝集彼此可產(chǎn)生偽像或關于融合蛋白的定位和功能的誤解。 但是，科學家們想出了一些答案的問題了。 其中，非極性氨基酸被親水性的物品所取代的突變，在臨界位置（F223R，L221K和A206K）顯示降低的二聚化。 所有這一切都導致頻譜的改善以及實際性狀的遺傳變化進行了總結下“強化”的FP的名字。

在wtGFP的情況下，增強導致的EGFP（增強型綠色熒光蛋白）與在488nm處，而不是以前復雜的吸收光譜在395納米和475納米的單激發(fā)峰。 wtGFP的第一個變異版本（S65T突變）由Roger錢永健等人開發(fā)的。 比原來更亮5倍，并呈現(xiàn)出更短的熟化時間。 連同更好熟化效率，在37℃，根據(jù)另一個突變（F64L），這起著對人們在看活細胞中起重要作用。

一個非常有趣的GFP變體的最大的斯托克斯位移一個是藍寶石 。 的突變的位置附近的發(fā)色團（T203I）導致的最大激發(fā)至399納米，最大發(fā)射至511毫微米的改變。 這是112毫微米的斯托克斯位移。 翡翠是另一個GFP的修飾具有改進的光穩(wěn)定性和亮度和更有效的折疊在哺乳動物細胞中。

而所有的綠色熒光蛋白具有相對較高的亮度，藍色熒光蛋白通常從微觀的應用減少了發(fā)光強度受到影響。 然而，它們用在因其他光譜特性的光學測定法。EBFP（增強型藍色熒光蛋白），通過多輪突變wtGFP構成。 第一個（Y66H）跳過從綠色發(fā)光峰的藍色光譜。 多個突變，隨后，產(chǎn)生的蛋白質具有最大激發(fā)，在380nm處，并在發(fā)光最大值位于448納米。 這些光譜特性使其成為EGFP在FRET徠卡顯微鏡的合作伙伴。 最近的藍色熒光蛋白具有較高的量子產(chǎn)率和更好的耐光性是石青，SBFP2和EBFP2。 一個有前途的EBFP繼任者是一個名為天狼這成為由于其極高的耐受性pH值（pH值從3-9穩(wěn)定）和其是用最短的發(fā)射波長至今的熒光蛋白信譽流行的一種蛋白質。

第二個“藍色”類的GFP變異體是由青色熒光蛋白的形成： 國家重點計劃 。 酪氨酸與色氨酸（Y66W）和進一步的遺傳改變的置換導致具有改善的亮度和光熒光染料。 這ECFP具有雙峰的激發(fā)和發(fā)射光譜在433/445 nm 和475/503 nm納米。 亮度是只有大約40％的該綠色熒光蛋白。 一個突出的ECFP變體是蔚藍 ，它具有更高的消光系數(shù)和量子產(chǎn)率。 它比ECFP更亮的1.5倍，并用作與YFP FRET的一個伙伴。

甲GFP的突變不直接改變中的發(fā)色團的三個中心氨基酸之一導致黃色熒光蛋白的升高。YFPs具有由酪氨酸（T203Y）交換一個共同的蘇氨酸，在位置203。 這種氨基酸是β桶的一部分，并位于靠近所述發(fā)色團。 相比于綠色熒光蛋白，激發(fā)和發(fā)射屬性已被轉換到更長的波長與激發(fā)和發(fā)射最大值在514納米和527納米（EYFP）。EYFP的一個特征是它的pH值敏感性。 在pH6.5 EYFP只有約50％的熒光，這并不總是一個缺點。 當涉及到pH測量（如囊泡，內體等），EYFP，可作為一個指標。 有趣的是，另外的突變（Q69M）開發(fā)出一種更好的酸穩(wěn)定性，并顯著改善了亮度（比EGFP亮的75％）。 這種蛋白質，它仍具有光穩(wěn)定性較差相比，EGFP，被稱為黃水晶 。 另一個YFP的突變體（F46L）呈顯著更快的成熟速度并且還改進的pH值電阻。 這種蛋白質被命名為金星 ，是一種常見的FRET受體與蔚藍。

從珊瑚蟲熒光蛋白

正如人們可以從第一部分看到，大多數(shù)的FP，來自水母答來 維多利亞發(fā)射光中的藍色到黃色的光譜。 紅色熒光蛋白的缺失。 俄羅斯科學家Sergey A. Lukyanov封閉的差距時，他發(fā)現(xiàn)的FP的珊瑚蟲。 紅色的FP具有比其他的一大優(yōu)勢，因為在細胞中的紅色光譜少得多的自體熒光。 此外，他們通過較長的波長，這是很好的活細胞興奮。 較短波長的光確實給標本遠遠更大的傷害。 珊瑚蛋白的過度水母蛋白的另一個一般性的優(yōu)點是在37℃下它們的有效的成熟。 而A. 維多利亞 GFP和衍生物不得不被遺傳修飾，以正確的方式折疊，珊瑚蟲綱蛋白成熟而不分子工程的必要性。 這可能是由于其生境的溫暖水溫。

• 

• 圖2：紅色熒光蛋白的分子結構

發(fā)現(xiàn)在珊瑚蟲最常用的FP的第一和靜止1是紅色熒光蛋白 。 這個名字是從海葵香菇芨而得。 紅色熒光蛋白具有最大激發(fā)，在558 nm和583 nm的發(fā)射峰。 然而，第一欣快停滯時結構信息發(fā)布。 紅色熒光蛋白maturates遠遠慢于水母的FP和具有中間色團的階段。 這一階段發(fā)出的光在綠色光譜和成因等FPS重疊。如已經(jīng)在GFP節(jié)所提到的，紅色熒光蛋白也有另一個問題。 紅色熒光?？鞍资且环N專性四聚體的傾向，以形成低聚物。 這可導致關于融合蛋白的定位和功能的誤解。 在一般的珊瑚蟲的FP具有相似的結構，以該多管水母FP的。 發(fā)色是藏在β桶結構，具有4納米×3納米（高×直徑）的大小。 不同之處在于，在珊瑚蟲β桶（圖2）的多橢圓形外觀。

與此同時，以綠色熒光蛋白“進化”，研究人員開始修改原來的紅色熒光蛋白，以克服其結構性缺陷。 第二紅色熒光蛋白產(chǎn)生- 的DsRed2 -具有減小的寡聚物形成趨勢和更快的成熟速度，減少綠色發(fā)光的中間階段。 進一步誘變導致了紅色的FP其中已完全喪失其四聚體狀態(tài)，但也喪失了一些它的量子產(chǎn)率（的DsRed2的25％）。 錢學森等人的這項工作。 是第一單體紅色熒光蛋白，因此被稱為mRFP1。

這mRFP1然后起點創(chuàng)立一組六單體的FP統(tǒng)稱為“mFruit”的。 他們的個人名得自其發(fā)光色：mHoneydew，mBanana，魔橙，mTangerine，mStrawberry和mCherry mCherry是最有用的，這些FP的，具有50％的該綠色熒光蛋白的亮度發(fā)射光中的610納米范圍內。

最亮的FP到目前為止是mFruit派的追隨者，并具有名稱tdTomato。 只要它被遺傳改變，dTomato是一種專性二聚體。 但二聚化被避免通過將兩個二聚化的伙伴在一個分子。 兩dTomato單元由一個12個氨基酸的接頭偶聯(lián)，產(chǎn)生串聯(lián)二聚體的FP tdTomato具有發(fā)射最大值在581納米和在最高的區(qū)域中的光穩(wěn)定性。

發(fā)射光譜，進一步移入遠紅光區(qū)域（630納米- 700納米）已創(chuàng)建另一個mFruit后繼時mPlum是mFruit構件與任何mFruit蛋白質在649 nm的最深的紅色發(fā)光。

科學地使用綠色熒光珊瑚蟲綱的蛋白質的量是非常小的，這是不令人驚奇鑒于公知的，用戶友好的A的情況的維多利亞 GFP。 顯然，人們并沒有看到任何必要建立一個新的綠色熒光蛋白。 不過也有一些，比如從石珊瑚Galaxeidae，Azami綠色明亮的熒光蛋白。 其序列同源性與綠色熒光蛋白是有趣小于6％。

一個珊瑚蟲綱FP這對深部組織成像的高影響Katushka。 對招標書的E.未來應用誘變 ?？?/em> ，Katushka被鑒定為具有發(fā)射最大值在635納米和所有的深紅色熒光蛋白的最高亮度級一種二聚體蛋白質。 Katushka的單體形式被稱為mKate并具有較高的亮度，供給以后，產(chǎn)生mKate2。

總之，所有這些今天用于顯微術，熒光蛋白是來自于原始的海洋生物。 表1包括最重要的那些連同像激發(fā)和發(fā)射最大值，耐光性，量子產(chǎn)率和亮度及其相關的光譜特性。

展望

什么被證明是一個非常有趣的故事是由脊椎動物表達了FP的發(fā)現(xiàn)。 文昌魚，一條小魚般的海洋脊索動物，產(chǎn)生AmphiGFP在其前側。 那個FP的序列分析預測一個典型的β桶結構，似乎是相關的橈足類Pontellina plumata的CopGFP（甲殼綱）。 這一發(fā)現(xiàn)表明，熒光的現(xiàn)象并不限于原始的無脊椎動物，但也可以在更高的進化階段動物中發(fā)現(xiàn)。 此外，這一發(fā)現(xiàn)表明熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)，處理和增強這仍然是研究的熱門話題的持續(xù)的過程。 這一事實證實的重要性和熒光蛋白在近期和未來生命科學研究的高沖擊。

熒光蛋白的光譜特性

表1：熒光蛋白
Ex：激發(fā)波長峰值（nm） 

Em：發(fā)射波長峰值（nm）

MW：分子量 
QY：量子產(chǎn)率 
BR：亮度; 消光系數(shù)*量子產(chǎn)率/ 1000 
PS：耐光性; 時間以50％的亮度（秒）