尼康顯微鏡熒光激發(fā)塊的雙激發(fā)組合

包括在尼康雙波段激發(fā)熒光濾光器組合是3每個包含兩個帶通發(fā)射區(qū)能夠通過藍色，綠色，黃色，橙色的窄頻帶，和紅光譜區(qū)域內有選擇地分離出的熒光發(fā)射小心平衡組合。 這個交互式指南探討了變化的激發(fā)和發(fā)射濾光器的光譜分布，以及這些的多色反光鏡，如何影響在設計用于多重標記的熒光基團的雙激發(fā)組合信號電平，頻譜交叉，整體過濾器的性能，并且圖像的對比度紫外線和藍色或藍綠色的區(qū)域。

本教程使用初始化出現在樣品圖像窗口和紫外線藍色雙通帶濾波器的激發(fā)塊組合（DAPI-FITC;默認值）隨機選擇的樣本的熒光光譜圖上的過濾器 ， 光譜曲線圖顯示。 熒光的吸收和發(fā)射光譜截面（帶過濾器的傳輸通帶重疊區(qū)域）可以通過選擇在光譜截面標題中列出相應的復選框（吸收或發(fā)射 ）單獨或集體觀看。 當一個或多個復選框被激活，將合并的過濾器的透射和反射光譜被疊加在所選擇的熒光團（多個）使用以標記樣品（熒光光譜曲線中不包含自身熒光植物標本）的吸收光譜和發(fā)射光譜。 熒光團的吸收光譜示于使用褐色填充的教程，而相應的發(fā)射光譜表示用灰色填充。 由過濾器設置滑塊指示的過濾器組合的波長特性顯示在教程中下部的黑色矩形框。 這些值被不斷地更新作為滑板平移由左到右。

為了操作的教程，使用過濾器設置滑塊可用于雙頻勵磁三濾組合之間進行轉換。 當滑塊從左向右平移，激發(fā)和阻擋濾光片的光譜分布，以及該多色鏡的，被修飾以模擬變化的光譜圖。需要注意的是連續(xù)變化的光譜曲線，但并不意味著任何過濾器的組合是可能的，也不是單獨的過濾器設置可變的（無物理變化的過濾器）的問候的光譜曲線。 的選擇的濾波器組之間的頻譜分布的變化簡單地用來幫助建立在每個光學塊中使用的過濾器的組合之間的關系。

各個過濾光譜 （激發(fā)，發(fā)射和多色反光鏡）可以通過選擇或取消選擇相應的復選框，圖形下方的添加或刪除的過濾器 ， 光譜曲線圖。 此外，該熒光團的吸收光譜和發(fā)射光譜可以被添加或與一組類似的復選框（ 頻譜截面 ）除去。 檢體圖像同時改變與過濾器配置文件以反映變化由改變到由滑塊的翻譯所產生的過濾器的組合產生的對比度和信號電平。 新的標本可以在任何時候選擇使用選擇的樣本下拉菜單，用來標記選定樣本的熒光基團直接列在菜單框下方。在所有的情況下，將樣品粘有兩個或更多的熒光探針以證明熒光的具有窄和寬的通帶阻（發(fā)射）過濾套的選擇性分離。

每個尼康顯微鏡雙波段熒光集被優(yōu)化用于結合異硫氰酸熒光素（FITC）的使用與任一4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），四甲基羅丹明異硫氰酸酯（TRITC）或Texas染料。 對應于這些熒光染料對相關的頻譜區(qū)的范圍從紫色激發(fā)和發(fā)射的藍光激發(fā)的綠色和紅色發(fā)光。 其他的熒光探針具有相似的光譜特性也是合適的，可單獨或成對，用于與尼康雙重激發(fā)熒光濾光片組合使用。

尼康DAPI-FITC雙帶濾波器組合結合具有一個帶通區(qū)域的紫色激發(fā)塊（400?418納米），連接到一個帶通發(fā)射（屏障）過濾器發(fā)射藍色熒光（450?465納米）激發(fā)濾光片在其信號的樂隊之一。 第二激發(fā)和發(fā)射波長組合此過濾器集使藍色激發(fā)在478至495納米的窄帶和檢測所產生的綠色熒光，在510到555納米范圍內的。 此過濾器設定功能的雙頻段提供最佳的同時檢測DAPI和FITC，當結合使用，專門針對不同的細胞成分。 在DAPI - 的Alexa Fluor 488的熒光染料對適用于該過濾器設置，以及，由于在問候的吸收和發(fā)射特性的Alexa Fluor探針和FITC光譜曲線的緊密相似性。

在雙激發(fā)濾鏡立方體，多色鏡的設計是至關重要的兩個熒光信號的分離，最好使它們具有最小串擾和噪聲的獨特的檢測。 而相比之下，在常規(guī)的組合中使用的標準長通分光濾波器，多頻帶濾波器組聘請改性二色性反射鏡與被精確地定位相對于所述多個激發(fā)和發(fā)射頻帶的多個帶通區(qū)域。 第一（下部）切于波長值的反射鏡定位在幾納米比短波長激發(fā)峰高，并開始一個傳輸頻帶完全圍繞對應的發(fā)光峰值，隨后突然傳輸截止。 這種設計使波長的反射在第二激發(fā)帶，同時經過了第一支樂隊創(chuàng)建的熒光發(fā)射。 在波長只是稍微比第二激發(fā)帶越高，反射鏡使另一個尖銳過渡到對應于所述第二發(fā)射通帶的帶通透射區(qū)域。 在DAPI-FITC激發(fā)塊組合使用的多色鏡具有適當地位于相對于每個激發(fā)塊補體，是具有一個截止波長為435納米，和另一個與截止波長的兩個帶通透射區(qū)域505納米。

薄膜干涉技術中的多頻帶濾波器組的制造技術的應用使得有可能以平衡的兩個（或更多）的熒光染料的熒光信號電平并提供最佳的攝像條件。 在許多過濾器的組合中，更短的（通常為紫外光或紫色）波長的激發(fā)峰的發(fā)送頻帶信息被減少，以平衡的發(fā)射信號電平，以及以最小化光致漂白和試件破壞。 這是在套設計用于與一種熒光團激發(fā)的紫光或紫外光譜區(qū)，使用特別重要，因為短波長輻射的高激發(fā)效率。 短波長激發(fā)峰的強度降低是在過濾器的組合，例如尼康DAPI-FITC組的透射光譜曲線的顯著特點。

用于同時檢測FITC標記的（或類似的熒光團），并激發(fā)在較長的波長，如TRITC的探針，所述的FITC-鬼筆雙頻帶濾波器組合提供藍色區(qū)域的激發(fā)綠色發(fā)光檢測，和綠色激發(fā)伴隨橙紅色排放檢測。 在此濾波器組，帶通區(qū)域為藍色激發(fā)綠色發(fā)光熒光素（FITC等）是從那些在DAPI-FITC集，以便最小化串擾的吸收綠光的熒光團采用稍加修改。 在這個組中使用的激發(fā)濾光器具有475至490納米（藍色激發(fā)），耦合到的503至530納米的發(fā)射（阻擋）濾波器的通帶（綠色發(fā)光），其是適合于FITC和類似的熒光團1的帶通區(qū)域。

FITC-TRITC濾光器組合的第二個頻帶使得激發(fā)塊在540?565納米的綠光波長范圍內，并且檢測對應于580和620納米之間的區(qū)域中的橙紅色發(fā)射。 雖然對FITC和TRITC熒光團的流行組合最優(yōu)化，也可以使用探針具有相似的吸收和發(fā)射光譜特性。 多色鏡（分束器）的帶通區(qū)域分別位于對應于激發(fā)和發(fā)射濾波器的窗口，在500和575納米的切口上的波長。

同時檢測FITC的（或類似的探針），并激發(fā)在綠色和黃綠色光譜區(qū)波長熒光染料，具有發(fā)射延伸到紅，由FITC-Texas濾光片組承擔。 激發(fā)塊頻帶為這個集（藍色和綠色光譜區(qū)）的范圍從490至505納米，并且從560到580納米。 相應的雙綠色和紅色發(fā)射頻帶是515至545納米和600至650納米，分別。 互補多色鏡切口上的波長的兩個信號的傳輸帶分別位于510和585毫微米。 規(guī)格為多色反光鏡和濾光片的三個尼康雙頻帶濾波器的組合列于表1中。

• DAPI-FITC -的DAPI-FITC過濾器組合被設計成用于同時從熒光染料DAPI和FITC或其它配對具有相似的光譜特性的熒光探針的檢測發(fā)射。 雙窄的激發(fā)和發(fā)射頻段對應于紫色激發(fā)的特定區(qū)域與相應的藍色發(fā)光和藍色激發(fā)塊耦合到綠色發(fā)光。

• FITC-TRITC -的FITC-TRITC濾光片組合是專為從熒光FITC和TRITC或探針對那些相似的光譜同時檢測排放。 帶通激發(fā)和發(fā)射濾光片允許兩個信號通道，一個對應于藍色激發(fā)綠色發(fā)光，另一個為綠色激發(fā)和橙紅色發(fā)射的特定的窄的區(qū)域。

• FITC-Texas Red -使用FITC-Texas Red濾光片組合的設計稍有不同的帶通區(qū)域為藍色激發(fā)綠色發(fā)光時相比，FITC-TRITC集，允許FITC標記的更有效的激發(fā)塊。這些變化符合稍高的波長范圍為德克薩斯紅（綠色激發(fā)塊;紅色發(fā)光）頻段。 多帶通地區(qū)的用戶提供最佳的檢測，以最小的串擾，對FITC和Texas或類似的光譜熒光雙同步可視化。