由于*分辨率已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)研究中*被看好的方法之一，這個(gè)詞越來越多的歡迎。 盡管如此，有關(guān)于什么是*分辨率是什么分辨率在所有相當(dāng)大的混亂。在這里，微觀解析經(jīng)典視圖討論一些技術(shù)，比傳統(tǒng)解決好了簡要介紹。 右邊的圖像示出了兩個(gè)點(diǎn)的距離僅僅是瑞利判據(jù)（假顏色編碼）的圖像的強(qiáng)度分布。

什么是分辨率？

在我們的情況下，分辨率是融合的相反。 當(dāng)出現(xiàn)的東西解決了，我們就可以區(qū)分分立元件。 在顯微術(shù)，有三種主要方法用來描述分辨率。 一個(gè)是阿貝公式，阿貝的名字命名。 他在透射光中研究了線性結(jié)構(gòu)

圖1：分辨率阿貝的定義。 假定樣本來代表的周期結(jié)構(gòu)，有必要收集至少*衍射級(jí)以創(chuàng)建一個(gè)圖像。 因此，該鏡頭的光圈必須足夠大：N×sinα= NA≥λ/ D，帶D的空間周期。 

該圖像示出了一個(gè)光柵（上面有一些灰塵），記錄有可變光圈透鏡，調(diào)節(jié)到正好解決的結(jié)構(gòu)。

對(duì)于有聚光鏡照明，分辨的*小距離到達(dá)

另一種是根據(jù)約翰W.斯特拉特，誰研究點(diǎn)狀發(fā)射器和定義的兩個(gè)點(diǎn)圖像作為光學(xué)離析，如果一個(gè)發(fā)射器的衍射圖案的*大正值的**小值，第二的衍射圖案的瑞利判據(jù)。 這導(dǎo)致

在這種情況下，存在兩個(gè)極大值，對(duì)應(yīng)于約所述*大值強(qiáng)度?之間的*小亮度。

圖2：瑞利判據(jù)。 兩個(gè)點(diǎn)被認(rèn)為是解決，如果一個(gè)點(diǎn)的中心落入其他點(diǎn)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（PSF）的*零。 

該標(biāo)準(zhǔn)僅適用于艾里般的專業(yè)服務(wù)公司。 萬一例如一個(gè)高斯分布的，沒有零在所有，該標(biāo)準(zhǔn)是不適用的。 其他標(biāo)準(zhǔn)，如麻雀準(zhǔn)則將與任何概要類型工作，因?yàn)樗傅氖蔷嚯x，其中所述圖案之間的*導(dǎo)數(shù)中途消失（“高原準(zhǔn)則”）。

很明顯，當(dāng)這種下降亮度甚至不太明顯點(diǎn)仍可以區(qū)分。 因此，一般討論的分辨率值是任意的，不能放下性質(zhì)，法律不管多少數(shù)學(xué)和衍射光學(xué)理論被應(yīng)用。

第三，更實(shí)際的方法是描述在半*大值（FWHM）的全寬,其光學(xué)懸而未決的結(jié)構(gòu)。 這個(gè)值是比較容易與任何顯微鏡來測量，并因此成為一種普遍接受的比較參數(shù)。 理論值是

圖3：左：由一個(gè)圓形的光圈點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（強(qiáng)度非線性增強(qiáng)，使暗淡的環(huán)可見）。 內(nèi)點(diǎn)稱為艾里磁盤。 右：簡介通過圓形衍射圖案的中心。 一個(gè)良好的，可衡量的特點(diǎn)是半*大強(qiáng)度全寬（FWHM =：D）。 

這一標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)是，它是容易測量的副分辨率特征顯微圖像。 用于校準(zhǔn)或極限的測量常常不同直徑的fluorochromed膠乳珠粒施加和測量。

如可以看到的，所有這些值 - 盡管具有非常不同的假設(shè)獲得 - 從平均值偏離小于10％。 這使得討論相當(dāng)容易：我們知道，我們不是做一個(gè)重大的錯(cuò)誤，如果我們簡單地把FWHM為觀察的分辨率參數(shù) - 這可比簡單的測量，是足夠接近

這些分辨率值，從物理和數(shù)學(xué)推導(dǎo)的假設(shè)時(shí)，是理論上的估算。 他們假設(shè)**的成像系統(tǒng)和光點(diǎn)在真空或完全均勻的襯底作為試樣。 當(dāng)然，這是從來沒有在現(xiàn)實(shí)生活中的情況下，更遑論在日常實(shí)驗(yàn)室操作。 一個(gè)特別嚴(yán)重的假設(shè)是，光在無限供給可用。 在現(xiàn)實(shí)中卻是沒有了，可測量的分辨率的信噪比（SNR）顯著依賴。 這也是顯而易見的，即典型的生物樣品，如腦切片做光學(xué)不表現(xiàn)為友好的真空。

基本上，測量結(jié)果，因此總是不如顯微鏡的光學(xué)分辨率。 這是要記住時(shí)，例如，檢查厚和弱染色的組織切片一個(gè)特別重要的一點(diǎn)！ 此外，該顯微鏡圖像是由許多衍射圖案的干擾，而不是僅僅一個(gè)或兩個(gè)而形成的。 要認(rèn)真對(duì)待，分辨率測量必須始終包含大量的讀數(shù)在不同位置的（和不同的樣品中，如果可能的話），然后得到的平均值與一個(gè)錯(cuò)誤。 這也是明顯的，例如，聲稱“我們已經(jīng)達(dá)到了197.48納米的分辨率”是一句廢話，而且肯定會(huì)更誠實(shí)地稱之為“200納米”。

什么是*分辨率？

前綴“*級(jí)”一詞源于拉丁文，意思是“上面”或“*越”。 因此*分辨率用于描述技術(shù)，增強(qiáng)了顯微鏡圖像的分辨率。 這立即導(dǎo)致混亂：它指的是（理論值）的光學(xué)拆分或可測量的分辨率的改進(jìn)的改進(jìn)當(dāng)圖像被記錄時(shí)，或兩者兼而有之？ 或者，它涉及到完全不同的技術(shù)，允許使用其他方法比那些經(jīng)典的光學(xué)理論的更高的分辨率？ 在一定程度上，所有的這些技術(shù)可以合理地被稱為“*分辨率”。 無論是技術(shù)，實(shí)際上是所謂的“*解像”與否是那么的哲學(xué)的問題或有意控制的意義。 但是，讓我們離開這個(gè)討論在這里一邊贊成全面提*顯著技術(shù)。 在這里，“分辨率”和“*分辨率”之間的界限是任意的，因此全權(quán)委托。

圖像復(fù)原（卷積）

光學(xué)儀器，如顯微鏡，可視化形式不同的對(duì)象。 它是一種顯微鏡的工作來放大不能用肉眼區(qū)分，使我們可以看到它們小的結(jié)構(gòu)。 不幸的是，事情總是時(shí)丟失這樣的圖像產(chǎn)生 - 我們不能不斷增加放大倍數(shù)在看到小結(jié)構(gòu)的希望。 這是因?yàn)槲矬w的微觀表示，無論多小，主要是由衍射的法律管轄。

圖4：共聚焦光學(xué)部分的圖像相比，具有細(xì)胞車廂與圖像的反褶積結(jié)果。 虛線表示在右側(cè)示出的強(qiáng)度分布。 表觀分辨率提高了FWHMs的比較是1.6倍。 還要注意的降噪和信號(hào)的峰值強(qiáng)度的增加。

因此，一個(gè)點(diǎn)狀的物體成像為一個(gè)衍射圖案。 這個(gè)衍射圖案是在“點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)”，什么樣的顯微鏡取得這一點(diǎn)的三維描述。 傳播通過光學(xué)系統(tǒng)被稱作“卷積”。 它可以計(jì)算這樣的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。 這是理想的光學(xué)和樣品的假設(shè)下計(jì)算的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)看起來很輝煌。 然而，*好是測量它們真正的樣品中，作為成像儀器和樣品的影響的所有光學(xué)像差則檢測為好。 解卷積的思想是將點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)之一的知識(shí)應(yīng)用于以恢復(fù)在該對(duì)象的原始光分布設(shè)置的三維記錄的圖像數(shù)據(jù)。

作為這種方法確實(shí)提高了實(shí)際記錄的圖像對(duì)象分離，去卷積有時(shí)被稱為一個(gè)類的*分辨率技術(shù)。 略低于2×橫向（x和y）方向上和略好于2×軸向改進(jìn)（z）的方向權(quán)利.

共聚焦顯微鏡

在共聚焦顯微鏡中，只有一個(gè)點(diǎn)被照射的時(shí)間，并從該點(diǎn)發(fā)出的光通過一個(gè)小針孔螺紋連接到所述檢測器，具有一個(gè)幾乎點(diǎn)狀探測器的影響的針孔。 粗略地說，人們已經(jīng)可以從該方法推測這種類型的系統(tǒng)是固有地不易于卷積干擾：當(dāng)整個(gè)領(lǐng)域被照亮，同時(shí)觀察到，所有的記錄的象素的數(shù)據(jù)包含其他空間元素的組分。 事實(shí)上，共聚焦成像導(dǎo)致非常薄的光學(xué)切片，受限衍射性質(zhì)。 對(duì)于正常的實(shí)踐中遇到的光學(xué)條件，Z軸的FWHM大約為XY值的兩倍。 傳統(tǒng)的顯微鏡 - 但是大 - 在軸向方向判斷信息的可能性。

以獲得從一個(gè)共聚焦顯微鏡中，對(duì)應(yīng)于圓形孔（艾里斑）的衍射圖的使用內(nèi)部盤的針孔直徑*好的結(jié)果。 這給出了一個(gè)截面厚度接近衍射極限，而不會(huì)丟失太多的光。 這是不可能的，以改善這樣的條件下的橫向分辨率。

圖5：分辨率表演在一個(gè)真正的共聚焦（單點(diǎn)）顯微鏡針孔直徑的函數(shù)（改編自曲線。光學(xué)切片性能示于黑色，紅色的橫向分辨率。 如果針孔具有衍射圖案（1 AU由灰色線表示）的內(nèi)盤的大小，進(jìn)一步關(guān)閉并不能改善切片，但會(huì)增加橫向分辨率。 在針孔零，切片厚度將假設(shè)的衍射極限，并且相比于廣角衍射極限的橫向分辨率是由√2倍更好。

所以，經(jīng)典的共聚焦圖象不*分辨率圖像至于橫向分辨率。 然而，橫向分辨率由針孔光闌進(jìn)一步收窄改善。 對(duì)于針孔的（當(dāng)然只是理論上的）的情況下，直徑為0，約1.4×的改進(jìn)可以預(yù)期如圖5中間（分1 AU-共聚焦），改進(jìn)是可能的。 臭名昭著敏感熒光的樣品，依靠高傳輸光學(xué)部件（AOBS和SP檢測器）和一個(gè)敏感的傳感器（在此，路政署是選擇）。 的優(yōu)點(diǎn)在于，沒有其它的修改是必要的，除了經(jīng)典的共聚焦顯微鏡（提供的設(shè)計(jì)滿足上述提到的條件）。

分辨率在上述定義的意義上說，可以附加地通過隨后的解卷積來增強(qiáng)。 在這里，高效率和探測器靈敏度有積極的作用，同樣，如去卷積算法期望適當(dāng)高信噪比。

圖像掃描顯微鏡

另一個(gè)想法改善共聚焦顯微鏡的分辨率被命 名為“圖像掃描顯微鏡”或“重新掃描共聚焦顯微鏡”。這種方法利用了以下事實(shí)：在一個(gè)共聚焦顯微鏡的圖像點(diǎn)的FWHM是稍窄中央衍射外盤比在中心的優(yōu)勢。 基本上，這是相當(dāng)于觀測一個(gè)中心位置很差針孔導(dǎo)致比井中心1稍好分辨率 - 盡管這是以巨大成本的強(qiáng)度。

理論上，人們可以預(yù)期在大約1.5×橫向分辨率的增益，如果記錄在許多信道的整個(gè)衍射圖像，然后分發(fā)到強(qiáng)度“正確”的像素。 然而，這僅適用于檢測器上一個(gè)無限大的面積無限數(shù)量。 在實(shí)踐中，這一因素是顯著小。 如果有改進(jìn)*過1.5×（例如1.7倍）一個(gè)要求，他們使用的是圖像掃描和去卷積的組合。 順便提及，這樣的顯微鏡失去能力，以產(chǎn)生光的部分，作為衍射圖案作為整體不再切斷。 如果一個(gè)人想恢復(fù)光學(xué)切片能力，就必須限制在檢測到的衍射圖案的區(qū)域中，以例如1.25 AU。 然而，這是幾乎相同的普通共聚焦顯微鏡用1.0 AU。 特別是，1.0和1.25 AU之間的強(qiáng)度分量僅為2％，作為一個(gè)零點(diǎn)交叉在1 AU; 上面和下面它也沒有太大的強(qiáng)度。

圖6：左：共聚焦（紅色和黑色曲線）和再掃描（藍(lán)色和黑色曲線）橫向和軸向性能比較。 重新掃描數(shù)據(jù)適于由。如果覆蓋1.25 AU衍射圖案的一小部分被用于重新掃描（藍(lán)色圓圈），橫向分辨率提高了一點(diǎn)，但是該切片是顯著惡化。 當(dāng)在0.6 AU（紅色圓圈）記錄共聚焦，橫向分辨率良好改善，并且切片性能接近衍射受限。 右：在圓形的PSF（黑色）和集成能量隨半徑的區(qū)域的徑向強(qiáng)度（對(duì)應(yīng)于針孔直徑）。 從1 AU焦點(diǎn)能量VS 1.25 AU分?jǐn)?shù)只有約2％的不同。

另外，這種儀器的設(shè)計(jì)通常是充滿從記錄象素的分割產(chǎn)生的其他損失。 這些損失容易加起來總強(qiáng)度的三分之一 ，因此比普通的共聚焦顯微鏡更大，例如，用≈0.6 AU的針孔直徑！

結(jié)構(gòu)照明

另一個(gè)不同的方法是使用結(jié)構(gòu)照明的技術(shù)。 這可以通過查看所謂云紋圖案，其由突出于彼此以不同的角度的頂部的兩個(gè)條紋圖案形成來理解。 如果一個(gè)人知道的條紋圖案中的一個(gè)，并測量了莫爾圖案，所以能夠計(jì)算出其它的條紋圖案。 這是結(jié)構(gòu)照明顯微鏡的情況完全相同。 在已知的條紋圖案是ILLUMI國，形成時(shí)的照明被折疊與該對(duì)象的結(jié)構(gòu)的圖案可以與一個(gè)攝像機(jī)來測量。 的兩條信息，然后采取以重構(gòu)第三，即結(jié)構(gòu)信息。 要做到這一點(diǎn)，然而，人們必須在至少三個(gè)不同的照明方向和三相錄制圖像。 更好的結(jié)果都與5個(gè)方向和5個(gè)階段，這意味著25個(gè)圖像記錄完全實(shí)現(xiàn)。 自然地，這需要一些時(shí)間，也科目所述樣本以相當(dāng)大的風(fēng)險(xiǎn)。 分辨率的增益是大約2倍。

到目前為止，所有描述的方法顯示細(xì)節(jié)知名度的潛在的改進(jìn)，在實(shí)現(xiàn)兩倍的分辨率之*。 因此，假設(shè)的約200nm為傳統(tǒng)的顯微鏡的值（使用綠光和為1.3數(shù)值孔徑的物鏡）的*好的一個(gè)可以希望用這種方法是100nm的分辨率。 下面的方法是在原則上是無限的。 決議實(shí)際達(dá)到只依賴于參數(shù)設(shè)置，樣品的效率和發(fā)射器本身的尺寸。

定位顯微鏡

一個(gè)點(diǎn)的圖像通過衍射圖案進(jìn)行說明。 在具有圓形孔的顯微鏡的情況下，這是艾里圖案。 如果一個(gè)人可以合理地，一個(gè)光點(diǎn)來自于一個(gè)單一的發(fā)射器（“單分子顯微鏡”），可以測量產(chǎn)生的艾里人物，演繹排放焦點(diǎn)。 一者來確定所述熒光電子系統(tǒng)的中心，因此。

有多種方法用于確保真正獨(dú)立的發(fā)射器被測量。 如果衍射圖中重疊，但仍然可區(qū)分正因?yàn)槿绱?，它們可以位于與分離算法。 它們可以被識(shí)別為單獨(dú)的實(shí)體通過顏色編碼，例如，或不同的閃爍頻率。 在時(shí)間的分離是*常見的方法中，其中所述發(fā)射器被打開或關(guān)閉。 也有此各種開關(guān)選項(xiàng)：漂白（僅關(guān)斷），從暗狀態(tài)隨機(jī)返回中，兩個(gè)非發(fā)光部分的分子，由另一染料分子的滅火隨機(jī)遭遇，有源開關(guān)具有不同光子能源等。 的結(jié)果始終是一個(gè)（至少暫時(shí)地）分離發(fā)射器的熒光形成在照相機(jī)芯片的艾里圖案。

圖7：單發(fā)射器的定位精度。 一）一個(gè)發(fā)射器（紅十字會(huì)）在廣場中心的理論P(yáng)SF。 雙箭頭指示的分布（r）的大小，由該衍射圖案給出。 b）在一系列單獨(dú)的排放藏品，三）協(xié)調(diào)優(yōu)勝劣汰PSF→（綠十字），D）的測量誤差這里顯示的例子的中心。 平均誤差是成反比的光子貢獻(xiàn)的測量的數(shù)量。

精度與該衍射圖中，可以再次確定的中心取決于衍射圖案本身（由發(fā)射波長和物鏡的數(shù)值孔徑確定的）的尺寸和上，可以在記錄過程中被收集光子的數(shù)目單個(gè)圖像的。

光子的數(shù)字越高，則較好的精確度，實(shí)際上它在理論上是可能實(shí)現(xiàn)無限的精度。

所以，對(duì)于給定的光的無限量的位置精度沒有物理限制。 這種位置測量的坐標(biāo)被傳輸?shù)綀D像存儲(chǔ)器和重復(fù)測量經(jīng)常（幾千圖像）與發(fā)射器開啟以隨機(jī)，以獲得熒光分子分布的相干圖像。 相同的發(fā)射器（具有不同的結(jié)果）的多個(gè)測量值不能被排除。 在這樣的圖像分辨率，然后由上述的位置精度來決定。

STED顯微鏡

*種方法來描述理論上是無限的分辨率使用一種現(xiàn)象叫做“受激發(fā)射”。這里，觸發(fā)光子激活熒光染料的從激發(fā)到基態(tài)的躍遷。 每個(gè)激光發(fā)生這種現(xiàn)象的優(yōu)勢。 如在“共聚焦顯微鏡”所描述的，共聚焦激光掃描顯微鏡照射只受衍射限制區(qū)域在任何一個(gè)時(shí)間。 這一地區(qū)是輻射的原因，它的大小決定了分辨率。 因此，減小了尺寸理論上應(yīng)該導(dǎo)致更高的分辨率。 用受激發(fā)射的技術(shù)，激發(fā)態(tài)可以發(fā)射過程發(fā)生之前熄滅。 所以，當(dāng)光即適合觸發(fā)激發(fā)射被引導(dǎo)到與激發(fā)射器的區(qū)域，在這個(gè)位置上的激發(fā)態(tài)可以被消滅或防止。 從該技術(shù)獲益，人們必須確保該耗盡激光聚焦在周圍的艾里圖案的中心的環(huán)狀。 否則，當(dāng)然，所有的熒光染料將受到影響，也沒有更多的圖像可以被記錄。 這種類型的圓形衍射圖案是比較容易實(shí)現(xiàn)通過將相位片插入照明光路。

圖8：在STED顯微鏡的衍射極限光點(diǎn)（上圖）的激勵(lì)。 藍(lán)色區(qū)域是由一個(gè)衍射受限的圓形光學(xué)產(chǎn)生受激分子的區(qū)域照亮。 照明用環(huán)形聚焦在受激發(fā)射觸發(fā)波長擦除激發(fā)區(qū)域外的特征，留下一個(gè)小區(qū)域?yàn)榘l(fā)射其導(dǎo)致增加的分辨率。

殘余區(qū)域現(xiàn)在取決于激勵(lì)面積與滅火環(huán)的“厚度”的比率。 這個(gè)尺寸是由衍射參數(shù)波長和數(shù)值孔徑再次確定。 此外，然而，它也由施加到該環(huán)形聚焦的能量來確定。 在此焦點(diǎn)的能量被耗盡激光的功率統(tǒng)治。 從理論上講，激光能量可能會(huì)承擔(dān)什么價(jià)值 - 只有一個(gè)限制由目前的技術(shù)發(fā)展。 的受激發(fā)射損耗技術(shù)，因此不被衍射限定。（奧林巴斯顯微鏡）

實(shí)際上決定了分辨率提高效率，在一個(gè)給定的損耗激光能量參數(shù)，為飽和強(qiáng)度I 周六 這是一個(gè)參數(shù)是由熒光染料的光物理控制。 比I / I中的阿貝式模型的分母適當(dāng)?shù)暮谋M的影響坐著實(shí)現(xiàn)。

圖9：關(guān)于增加枯竭激光在顯微鏡STED影響。 *列：激發(fā)區(qū)域。 本是恒定的所有實(shí)施例，作為激發(fā)強(qiáng)度不改變。 第二列：視圖耗盡激光的強(qiáng)度增加，從上到下的衍射圖案。 第三列：激發(fā)和枯竭的疊加。 第四柱：殘余激勵(lì)區(qū)域，這降低了與日益枯竭功率。 理論上提供衍射限制的分辨率。

STED提供了許多優(yōu)點(diǎn)，這使得它對(duì)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究的理想工具。 首先：它是一個(gè)即時(shí)的方法。 在一次掃描生成圖像 - 隨后的數(shù)量沒有記錄成千上萬的圖像運(yùn)算，因?yàn)樗桥c定位技術(shù)的情況。 這是為生命成像以高幀頻，試圖做生理相關(guān)的實(shí)驗(yàn)時(shí)，一絕至關(guān)重要。 此外，還可以組合一系列不同熒光的，對(duì)于在空間和時(shí)間上信號(hào)的相關(guān)的一個(gè)先決條件。 雖然系統(tǒng)是一個(gè)不小規(guī)模的顯微鏡，這有一個(gè)很好的理由。 作為一個(gè)共聚焦掃描顯微鏡的衍生物，共聚焦顯微鏡固有包括作為替代的成像方法。