奧林巴斯顯微鏡測(cè)試目標(biāo)強(qiáng)度掃描

在光學(xué)顯微鏡的光學(xué)性能通常通過其響應(yīng)成像被用來測(cè)量對(duì)比度傳遞函數(shù)的高對(duì)比度周期線光柵時(shí)確定的。一個(gè)理想的測(cè)試目標(biāo)（MBL-NNF）為此在海洋生物實(shí)驗(yàn)室在伍茲霍爾，馬薩諸塞州與國(guó)家納米制造設(shè)施在康奈爾大學(xué)合作開發(fā)的。

除了周期性的線間距，所述MBL-NNF測(cè)試目標(biāo)提供單和配對(duì)線和點(diǎn)和一個(gè)測(cè)試西門子星（圖1），它允許一個(gè)仔細(xì)分析由這些微觀特征產(chǎn)生的一個(gè)函數(shù)的衍射圖案的兩個(gè)照明模式。

互動(dòng)教程演示，從目前的一個(gè)平場(chǎng)復(fù)消色差物鏡測(cè)MBL-NNF測(cè)試目標(biāo)的定期線圖案使強(qiáng)度掃描。 光柵分別以515納米的激光波長(zhǎng)和0.82的聚光鏡的數(shù)值孔徑成像的由在非共焦的傳送模式的掃描激光顯微鏡以40倍/ 0.95 NA物鏡。 強(qiáng)度進(jìn)行平均平行于光柵線條的尺寸。 要查看強(qiáng)度的整個(gè)范圍，將滑塊移動(dòng)到無論是左（較低的空間頻率）或右（高空間頻率）。 需要注意的是強(qiáng)度取決于空間頻率時(shí)，作為*大的在低頻和*低處的更高的頻率。

輸出信號(hào)的調(diào)制，光波的形成樣品的圖像的強(qiáng)度，對(duì)應(yīng)于在顯微鏡圖像對(duì)比度的形成。 因此，MTF對(duì)于特定的光學(xué)顯微鏡的測(cè)定可以由周期線或間隔存在于一個(gè)樣品所造成的圖像中的正弦強(qiáng)度而變化作為空間頻率的函數(shù)產(chǎn)生的對(duì)比度而獲得。 如果具有1微米（交替吸收和透明線對(duì)之間的距離）的空間周期的檢體，使用浸油成像在高數(shù)值孔徑（1.40）與匹配的物鏡/聚光鏡對(duì)，各個(gè)線對(duì)將被清楚地分辨在顯微鏡。 該圖像將不會(huì)是一個(gè)忠實(shí)的再現(xiàn)線對(duì)圖案的，而是會(huì)具有的深色和淺色條紋間對(duì)比度的中等程度。 降低線對(duì)之間的距離為0.5微米的空間周期（空間頻率等于每毫米2000線）將進(jìn)一步降低在*終圖像對(duì)比度，但增加了空間周期為2微米（空間頻率等于每毫米500線）將產(chǎn)生的圖像對(duì)比度的相應(yīng)增加。

當(dāng)空間頻率接近每毫米（空間周期等于0.2微米）5000線，采用的500納米照射波長(zhǎng)在高數(shù)值孔徑（1.4）達(dá)到用光學(xué)顯微鏡的分辨率極限。 在這一點(diǎn)上，對(duì)比度將是幾乎檢測(cè)不到與圖像會(huì)出現(xiàn)灰色的中性色調(diào)。 在真實(shí)的標(biāo)本，對(duì)比度在顯微鏡中觀察到的量取決于圖像的大小，亮度和顏色，但人眼不再檢測(cè)周期性在相反的水平低于約百分之三到五對(duì)緊密間隔的條紋和可能達(dá)不到分辨率的0.2微米的限制。

*終，在顯微鏡達(dá)到限制空間頻率（截止頻率），這是關(guān)系到物鏡的數(shù)值孔徑（NA）和照明波長(zhǎng)（λ）由下式：

這種關(guān)系表示，在空間頻率的事實(shí)具有較大的數(shù)值孔徑和更短的波長(zhǎng)照射在顯微鏡的分辨率提高的方面。 光學(xué)分辨率的另一個(gè)指標(biāo)， 羅利兩點(diǎn)準(zhǔn)則，基于所述點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的分布寬度。 兩點(diǎn)是在檢體相鄰分布由光學(xué)系統(tǒng)分成兩個(gè)單獨(dú)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。 這些點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的分布的寬度決定的各點(diǎn)的接近程度可以彼此并仍然通過奧林巴斯顯微鏡來解決。

當(dāng)使用相轉(zhuǎn)移函數(shù)相結(jié)合，光學(xué)系統(tǒng)的調(diào)制傳遞函數(shù)變?yōu)楣鈱W(xué)傳遞函數(shù)，這是點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的傅立葉變換。 傅立葉變換的一個(gè)基本屬性是一個(gè)函數(shù)的分布寬度成反比其傅立葉變換的分布寬度。 考慮截止頻率以上時(shí)，點(diǎn)擴(kuò)展函數(shù)的一階衍射環(huán)的半徑（r）所討論的數(shù)值孔徑之間的關(guān)系（或艾里斑）表示由等式：

很明顯，r和f（c）是成反比彼此所要求的傅立葉理論。 要注意，在光學(xué)顯微鏡不會(huì)突然停止解決間距是小于阿貝極限是很重要的。 取而代之的是在具有增加的空間頻率，往往使試樣具有低固有對(duì)比度，即使當(dāng)它們被隔開的距離大于所述顯微鏡的分辨率極限無法解決的圖象對(duì)比度的逐步下降。