激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用
2020-09-04 09:48:33
傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場光源，標(biāo)本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光掃描共焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用點光源照射樣本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照射光路回送到由雙色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點被擋在探測針孔之外不能成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)切面，避免了非焦平面上雜散光線的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點，因此能得到整個焦平面上清晰的共聚焦圖像。
原理圖
二、激光掃描共聚焦顯微鏡組成特點
LSCM由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測系統(tǒng)構(gòu)成，整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平臺界面中方便靈活地進(jìn)行。顯微鏡是LSCM的主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在切片、活細(xì)胞檢測等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用更廣泛。
三、激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用
一）細(xì)胞的三維重建
二）靜態(tài)結(jié)構(gòu)檢測：原位鑒定細(xì)胞或組織內(nèi)生物大分子、觀察細(xì)胞及亞細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)
1.細(xì)胞原位檢測核酸
用于細(xì)胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀察、檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制及斷裂情況以及染色體定位觀察。
2.原位檢測蛋白質(zhì)、抗體及其他分子
原位檢測蛋白質(zhì)、抗體及其他分子
免疫熒光標(biāo)記技術(shù)
檢測熒光蛋白
3.檢測細(xì)胞凋亡
檢測細(xì)胞凋亡不同時期細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白
4.細(xì)胞器觀察及測定
探針可以直接跨過死細(xì)胞或活細(xì)胞膜，選擇性地與特定細(xì)胞器結(jié)合
5.檢測細(xì)胞融合
6.觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)
7.觀察細(xì)胞間縫隙連接通訊
8.檢測細(xì)胞內(nèi)脂肪
尼羅紅檢測動物組織中或體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量
三）動態(tài)觀察：活體細(xì)胞或組織功能的實時動態(tài)檢測
1.實時定量測定細(xì)胞內(nèi)鈣的變化
鈣離子濃度測定和比率成像
2.測定細(xì)胞內(nèi)PH變化
同一種探針BCECF，分別用不同激發(fā)峰激發(fā)得到的熒光比例，探究PH變化
3.檢測膜電位的變化
JC-1低電位下單體存在，發(fā)綠色熒光；高電位下J-聚集體，發(fā)紅色熒光，隨電位增加，紅色熒光也增加
4.檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生
5.藥物篩選
v檢測藥物等跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞過程及定位
v對藥物、病毒、細(xì)菌等熒光標(biāo)記，檢測是否進(jìn)入、位置含量、動態(tài)過程
6.檢測熒光共振能量轉(zhuǎn)移-FRET
GFP和YFP，BFP和GFP等研究大分子間的相互作用
7．囊泡運輸研究
利用胞吞/胞吐探針FM4-64，結(jié)合激光共聚焦、電鏡、TIRF，檢測囊泡的運動過程，探討B(tài)FA對胞吞/胞吐過程的影響。
8.檢測熒光漂白恢復(fù)
將待測細(xì)胞用熒光物質(zhì)標(biāo)記，淬滅；低強度激光掃描成箱，非淬滅分子移動，直接反映熒光標(biāo)記物質(zhì)及其結(jié)合物的運動，因此可用來研究縫隙連接通訊的快慢.
綜上所述，激光掃描共焦顯微鏡由于其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點，在細(xì)胞水平上可作多種功能測量和分析，成為分析細(xì)胞學(xué)的一項重要研究手段。隨著LSCM設(shè)備和應(yīng)用技術(shù)的不斷完善，它在生物醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域里將起到更重要的作用。