激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和應用
2020-09-04 09:48:33
傳統(tǒng)的光學顯微鏡使用的是場光源，標本上每一點的圖像都會受到鄰近點的衍射或散射光的干擾；激光掃描共焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)采用點光源照射樣本，在焦平面上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照射光路回送到由雙色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。照明針孔與探測針孔相對于物鏡焦平面是共軛的，焦平面上的點同時聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點被擋在探測針孔之外不能成像，這樣得到的共聚焦圖像是標本的光學切面，避免了非焦平面上雜散光線的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點，因此能得到整個焦平面上清晰的共聚焦圖像。
原理圖
二、激光掃描共聚焦顯微鏡組成特點
LSCM由顯微鏡光學系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測系統(tǒng)構成，整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平臺界面中方便靈活地進行。顯微鏡是LSCM的主要組件，它關系到系統(tǒng)的成像質量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在切片、活細胞檢測等生物醫(yī)學應用中使用更廣泛。
三、激光掃描共聚焦顯微鏡的應用
一）細胞的三維重建
二）靜態(tài)結構檢測：原位鑒定細胞或組織內生物大分子、觀察細胞及亞細胞形態(tài)結構
1.細胞原位檢測核酸
用于細胞核定位及其形態(tài)學觀察、檢測細胞內DNA的復制及斷裂情況以及染色體定位觀察。
2.原位檢測蛋白質、抗體及其他分子
原位檢測蛋白質、抗體及其他分子
免疫熒光標記技術
檢測熒光蛋白
3.檢測細胞凋亡
檢測細胞凋亡不同時期細胞形態(tài)、細胞凋亡相關蛋白
4.細胞器觀察及測定
探針可以直接跨過死細胞或活細胞膜，選擇性地與特定細胞器結合
5.檢測細胞融合
6.觀察細胞骨架結構
7.觀察細胞間縫隙連接通訊
8.檢測細胞內脂肪
尼羅紅檢測動物組織中或體外培養(yǎng)細胞內脂滴含量
三）動態(tài)觀察：活體細胞或組織功能的實時動態(tài)檢測
1.實時定量測定細胞內鈣的變化
鈣離子濃度測定和比率成像
2.測定細胞內PH變化
同一種探針BCECF，分別用不同激發(fā)峰激發(fā)得到的熒光比例，探究PH變化
3.檢測膜電位的變化
JC-1低電位下單體存在，發(fā)綠色熒光；高電位下J-聚集體，發(fā)紅色熒光，隨電位增加，紅色熒光也增加
4.檢測細胞內活性氧物種的產(chǎn)生
5.藥物篩選
v檢測藥物等跨膜進入組織或細胞過程及定位
v對藥物、病毒、細菌等熒光標記，檢測是否進入、位置含量、動態(tài)過程
GFP和YFP，BFP和GFP等研究大分子間的相互作用
7．囊泡運輸研究
利用胞吞/胞吐探針FM4-64，結合激光共聚焦、電鏡、TIRF，檢測囊泡的運動過程，探討B(tài)FA對胞吞/胞吐過程的影響。
8.檢測熒光漂白恢復
將待測細胞用熒光物質標記，淬滅；低強度激光掃描成箱，非淬滅分子移動，直接反映熒光標記物質及其結合物的運動，因此可用來研究縫隙連接通訊的快慢.
綜上所述，激光掃描共焦顯微鏡由于其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點，在細胞水平上可作多種功能測量和分析，成為分析細胞學的一項重要研究手段。隨著LSCM設備和應用技術的不斷完善，它在生物醫(yī)學和生命科學領域里將起到更重要的作用。