徠卡顯微鏡，F(xiàn)LCS - 熒光相關(guān)光譜進(jìn)展
在單分子水平的表征物質(zhì)已成為的標(biāo)準(zhǔn)劇目科研院所的一部分。*常用的方法之一，是熒光相關(guān)光譜（FCS），它可以用來(lái)檢查的動(dòng)態(tài)性和在溶液中的熒光分子濃度。本文介紹了一種測(cè)量技術(shù)，結(jié)合了經(jīng)典的FCS測(cè)量與時(shí)間相關(guān)的單光子計(jì)數(shù)，以獲得更精確和可靠的結(jié)果。
FCS是經(jīng)常被用來(lái)研究的分子在溶液中的動(dòng)態(tài)過(guò)程。然而，實(shí)驗(yàn)因素嚴(yán)重影響的分析，如FCS數(shù)據(jù)記錄。典型的因素包括工件的測(cè)量系統(tǒng)中，雜散光的熒光基團(tuán)的三線態(tài)，雜質(zhì)或背景的樣品。由于這些因素不是恒定的，但樣本間差別很大，一個(gè)FCS實(shí)驗(yàn)的分析往往是問(wèn)題，而且容易出錯(cuò)。因此，*好是根據(jù)物理定律，然后再執(zhí)行一個(gè)特定的數(shù)據(jù)分析來(lái)清潔數(shù)據(jù)記錄。
遵循一個(gè)明確的數(shù)學(xué)分布概率的物理值，熒光衰減。這里所描述的方法，熒光壽命相關(guān)光譜（FLCS）使用清潔FCS數(shù)據(jù)集的熒光衰減行為。FLCS可以使用，例如，以消除工件的測(cè)量系統(tǒng)或單獨(dú)的數(shù)據(jù)記錄從一些熒光基團(tuán)的混合物，然后可以逐個(gè)進(jìn)行分析。這種類型的評(píng)估產(chǎn)生明確和可重復(fù)性的結(jié)果，即使是*小的熒光濃度。
單分子光譜
在七十年代推出的熒光相關(guān)光譜的原理描述了在橢球體積溶液中單分子熒光研究。結(jié)合共聚焦顯微鏡，，F(xiàn)CS已成為一個(gè)重要的測(cè)量方法，為研究分子動(dòng)力學(xué)和濃度。
在一個(gè)FCS的實(shí)驗(yàn)中，典型的連續(xù)的激勵(lì)光聚焦到一個(gè)點(diǎn)在紙巾或溶液。通過(guò)使用共聚焦設(shè)置時(shí)，可以觀察到分子內(nèi)的體積為約0.3毫微微升（圖1A）。此卷是由激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，客觀和共焦針孔的大小。
實(shí)驗(yàn)本質(zhì)上是基于布朗運(yùn)動(dòng)的分子擴(kuò)散通過(guò)檢測(cè)量，很高興和發(fā)光。測(cè)量的對(duì)象是由此產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化（圖1B），然而，可能的影響，以及由其他光物理過(guò)程。
分析FCS的數(shù)據(jù)的*個(gè)步驟是從測(cè)得的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出的自相關(guān)。然后，一個(gè)合適的模型函數(shù)的變參數(shù)裝配到所得到的自相關(guān)函數(shù)（ACF），從其中，例如，所產(chǎn)生的熒光團(tuán)濃度或擴(kuò)散常數(shù)。ACF進(jìn)行分析時(shí)，所面臨的挑戰(zhàn)是找到一個(gè)合適的模型描述不僅實(shí)際性能的熒光，也影響實(shí)驗(yàn)因素與可變參數(shù)函數(shù)。每個(gè)額外的影響需要至少一個(gè)附加的參數(shù)的復(fù)雜性和分析的傾向，因此，包含錯(cuò)誤增加。如果樣品有一個(gè)以上的熒光基團(tuán)，每個(gè)熒光團(tuán)的擴(kuò)散行為影響所得的ACF，這不是一個(gè)簡(jiǎn)單的線性組合的情況，而是一個(gè)復(fù)雜的各個(gè)信號(hào)的疊加。
圖 1：插圖的FCS實(shí)驗(yàn)。（A）測(cè)量體積（深藍(lán)色）的聚焦激光束在聚焦。（B）上記錄一個(gè)FCS數(shù)據(jù)記錄和計(jì)算的自相關(guān)函數(shù)的熒光強(qiáng)度的波動(dòng)的。
不同的方法
多年來(lái)，已經(jīng)建立了各種版本的FCS來(lái)處理的與ACF的分析相關(guān)聯(lián)的問(wèn)題。所有這些方法的目的是清潔背景工件的數(shù)據(jù)，并允許同時(shí)研究一些熒光的分子。
*常用的方法是熒光互相關(guān)光譜法（FCCS），在其中的熒光，同時(shí)記錄與兩個(gè)檢測(cè)器。探測(cè)器后脈沖的*常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)工件之一，例如，可以消除與FCCS。這是一個(gè)的幻像脈沖發(fā)生在檢測(cè)器的反饋所造成的在測(cè)量過(guò)程中。分配相等的部分所發(fā)射的光子在兩個(gè)檢測(cè)器上，然后從兩個(gè)數(shù)據(jù)記錄計(jì)算出的互相關(guān)的干擾信號(hào)被刪除。
FCCS還允許具有不同的光譜發(fā)射波長(zhǎng)的熒光團(tuán)分離，從而使單獨(dú)的數(shù)據(jù)分析用于確定擴(kuò)散常數(shù)和濃度。除此之外，交叉的兩個(gè)信號(hào)的相關(guān)性提供了一個(gè)潛在的相互作用的分子受調(diào)查的信息。然而，實(shí)驗(yàn)裝置的復(fù)雜性，不應(yīng)該被低估。單獨(dú)檢測(cè)的熒光基團(tuán)的檢測(cè)量有重疊的100％，這是由于檢測(cè)音量大小的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)的依賴性非同小可。此外，*光譜分離的熒光可以經(jīng)常不實(shí)現(xiàn)，這反過(guò)來(lái)又使數(shù)據(jù)記錄的分析更加困難。
數(shù)學(xué)的其他方式的數(shù)據(jù)分開(kāi)，實(shí)例中的擴(kuò)散系數(shù)的差別的基礎(chǔ)上。然而，必須不同的分子的擴(kuò)散系數(shù)（至少）1.6，得到有用的結(jié)果的一個(gè)因素。因此，這種測(cè)量方法并不分子濃度或擴(kuò)散常數(shù)進(jìn)行簡(jiǎn)單的閱讀，而是基于高度復(fù)雜的數(shù)學(xué)擬合的ACF，包括假設(shè)一般不可能通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，因此極其容易出錯(cuò)。
通過(guò)時(shí)間相關(guān)的單光子測(cè)量的改進(jìn)
熒光壽命相關(guān)光譜的方法，可以規(guī)避上述問(wèn)題。FLCS實(shí)驗(yàn)中，不僅熒光強(qiáng)度的時(shí)間變化，而且還有具體的一個(gè)脈沖激發(fā)后的熒光基團(tuán)的熒光衰減行為的測(cè)量，然后用于清洗的FCS數(shù)據(jù)記錄。FLCS，而不是假設(shè)的測(cè)定數(shù)據(jù)的分析，基于純數(shù)學(xué)的評(píng)價(jià)方法。
基本上，F(xiàn)LCS FCS和時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（TCSPC），這是*適合的方法，用于測(cè)量單個(gè)分子的熒光衰減行為的組合。TCSPC需要的脈沖激勵(lì)激光器和單光子靈敏的檢測(cè)器。
實(shí)驗(yàn)原理
對(duì)于FLCS實(shí)驗(yàn)，TCSPC測(cè)量是在一個(gè)特殊的“時(shí)間標(biāo)記的時(shí)間分辨”（TTTR）測(cè)量模式。在這里，兩個(gè)相互獨(dú)立的為每個(gè)檢測(cè)到的光子的時(shí)間的測(cè)量：首先，在激勵(lì)脈沖的發(fā)病和到達(dá)的檢測(cè)器信號(hào)（微觀到達(dá)時(shí)間）以皮秒分辨率，其次從實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的時(shí)間之間的時(shí)間注冊(cè)的特定的光子（宏觀到達(dá)時(shí)間）。
的微觀的到達(dá)時(shí)間被用來(lái)產(chǎn)生一個(gè)的TCSPC直方圖，描述了特定的熒光衰減行為。就像在任何經(jīng)典FCS實(shí)驗(yàn)宏觀到達(dá)時(shí)間可以用來(lái)計(jì)算出的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，并確定通過(guò)計(jì)算的ACF的擴(kuò)散系數(shù)和濃度。
對(duì)于一個(gè)FCS的實(shí)驗(yàn)中，熒光團(tuán)的混合物連續(xù)激發(fā)，也有一定的概率為每個(gè)檢測(cè)到的單光子發(fā)射的熒光團(tuán)或熒光基團(tuán)B.這個(gè)概率是恒定的時(shí)間，因?yàn)闆](méi)有定義的時(shí)刻激發(fā)。FLCS是基于一個(gè)簡(jiǎn)單的事實(shí)脈沖激發(fā)產(chǎn)生激發(fā)一個(gè)特定的時(shí)間，這意味著一個(gè)光子所發(fā)出的熒光基團(tuán)A或熒光基團(tuán)乙變化的時(shí)候（圖2A）的檢測(cè)概率。檢測(cè)到的光子激發(fā)后不久可能發(fā)射的更快的衰減的熒光基團(tuán)（壽命變短），，而晚光子更有可能被發(fā)射的速度較慢的衰減熒光團(tuán)（更長(zhǎng)的壽命）。隨時(shí)間變化的檢測(cè)概率的基礎(chǔ)上，有數(shù)學(xué)方法可以應(yīng)用到統(tǒng)計(jì)概率原產(chǎn)概率分配的過(guò)濾器，每個(gè)光子的到達(dá)時(shí)間（圖2B）。
圖 2：（A）兩個(gè)熒光基團(tuán)的熒光衰變行為A（紅色）和B（藍(lán)色）以及混合物（黑色）。（B）分配給每個(gè)光子的到達(dá)時(shí)間與從熒光團(tuán)發(fā)射的光子的概率統(tǒng)計(jì)濾波功能A（紅色）或B（藍(lán)色）。
要設(shè)置一個(gè)合適的分配濾波器，對(duì)應(yīng)的直方圖的構(gòu)成成分是必需的，除了TCSPC測(cè)量本身的直方圖。如果，例如，人們希望分開(kāi)的熒光基團(tuán)，TCSPC直方圖純熒光團(tuán)是必要的。要?jiǎng)h除不帶熒光基團(tuán)的雜散光成分的測(cè)量，一個(gè)額外的測(cè)量是必要的。分布過(guò)濾器，然后分配給每個(gè)光子的光子的概率來(lái)源于特定組件的抵達(dá)時(shí)間。因此，此數(shù)據(jù)分離發(fā)生在單光子水平。分離的數(shù)據(jù)記錄可以彼此獨(dú)立地進(jìn)行分析計(jì)算ACF。
這種類型的統(tǒng)計(jì)分析不僅適用于所檢測(cè)的熒光團(tuán)的排放量，但同樣適合用于描述工件的測(cè)量系統(tǒng)，例如暗計(jì)數(shù)率和后脈沖檢測(cè)器（圖3A）。關(guān)于這一主題的文學(xué)已經(jīng)包含了成功的例子分裂的測(cè)量數(shù)據(jù)記錄到多達(dá)4個(gè)的子組件。
一般來(lái)說(shuō)，它是重要的，F(xiàn)LCS要注意的是使用分離的和整個(gè)熒光衰減行為，可確定從它的平均熒光壽命。可以在數(shù)學(xué)上彼此分開(kāi)的熒光基團(tuán)或組件，如果他們顯示在的TCSPC直方圖的不同的配置文件。
示例應(yīng)用
的功能性，有效性和穩(wěn)定性的FLCS方法已被證明在極其廣泛的應(yīng)用范圍，不僅在體外而且在體內(nèi)。即使在簡(jiǎn)單的分析只有非常小的熒光染料濃度的FCS的實(shí)驗(yàn)中，使用FLCS導(dǎo)致更高的精度和再現(xiàn)性分子濃度和擴(kuò)散速度的測(cè)量。圖3示出FLCS測(cè)量的染料Atto655，溶解在乙二醇。由于大的雜散光成分在低摩爾的解決方案中，只有約60％的檢測(cè)到的光子起源從染料，其中所確定的熒光團(tuán)濃度有負(fù)面影響。在比較有和沒(méi)有生命周期的濾波的數(shù)據(jù)分析的自相關(guān)曲線（圖3C），可以看出，通過(guò)消除測(cè)量的背景，其中包含雜散光系統(tǒng)構(gòu)件（圖3A 和圖3B ，紅色線），遠(yuǎn)小的分子數(shù)被檢測(cè)到，構(gòu)成設(shè)定的分子溶液的濃度（下午10點(diǎn)）的良好近似。該方法也被體內(nèi)的小區(qū)的測(cè)量，其中FLCS用于去除來(lái)自數(shù)據(jù)記錄 在單元格中存在的黃酮類和NADH分子施加巨大的成功。
在法國(guó)巴黎狄德羅大學(xué)的的實(shí)驗(yàn)室Ma?té酒店Coppey穆瓦桑*近能夠證明，它也有可能在體內(nèi) FCCS實(shí)驗(yàn)，以除去在與熒光蛋白GFP和mCherry的的mCherry檢測(cè)通道中的綠色熒光蛋白的光譜串?dāng)_。在這里，在GFP激發(fā)用脈沖激光和連續(xù)波激光的mCherry。這使一種蛋白質(zhì)相互作用研究的ACF沒(méi)有數(shù)學(xué)擬合。
圖 3：FLCS實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)特定的測(cè)量工件內(nèi)的影響和消除。（A）的TCSPC直方圖染料的Atto655的溶于乙二醇（黑色）10日下午，在水（100分，藍(lán)）和背景（紅色），純Atto655的。（B）的統(tǒng)計(jì)過(guò)濾功能分配給每個(gè)光子的到達(dá)時(shí)間的光子來(lái)源于熒光團(tuán)（藍(lán)色）或背景（紅）的概率。發(fā)射Atto655檢測(cè)到的光子的概率增加的延遲時(shí)間越長(zhǎng)。（C）的自相關(guān)函數(shù)（黑色）和（紅色）壽命過(guò)濾FCS數(shù)據(jù)集的記錄。
總結(jié)
FLCS是一個(gè)復(fù)雜的方法確定分子的濃度和動(dòng)力學(xué)。由于其物理法，熒光衰減行為，或許可以用一個(gè)統(tǒng)計(jì)分布的概率，這是很有用的分離的測(cè)量數(shù)據(jù)和清洗工件的FCS數(shù)據(jù)記錄。FLCS從而使分子的濃度和擴(kuò)散時(shí)間更精確和可重復(fù)的決心。這反過(guò)來(lái)又導(dǎo)致生成的數(shù)據(jù)之間的可比性，不同的測(cè)量系統(tǒng)之前，現(xiàn)在這是不可能的。